VEGF、L-蛋氨酸对绒山羊次级毛囊外根鞘细胞增殖和分化的影响

发布时间：2017-05-21 09:08

  本文关键词：VEGF、L-蛋氨酸对绒山羊次级毛囊外根鞘细胞增殖和分化的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本研究旨在研究陕北白绒山羊毛囊外根鞘细胞的体外培养,并通过在培养液中分别添加VEGF和L-蛋氨酸,检测它们对次级毛囊外根鞘细胞的增殖、分化的影响,以及VEGF对次级毛囊外根鞘细胞中FGF5 mRNA表达量的影响,来阐述外根鞘细胞在次级毛囊周期中的作用,为进一步研究绒山羊次级毛囊发育机制提供理论支持。采集陕北白绒山羊体侧部皮肤,通过剪碎、消化、剥离等方法分离初、次级毛囊,再将分离出的毛囊消化得到外根鞘细胞,并置于在37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养;选用第5代次级毛囊外根鞘细胞,分别添加不同浓度血管内皮生长因子(ascular endothelial growth factor,VEGF)和L-蛋氨酸,分别处理24 h、48 h,噻唑兰比色法(Methyl thiazolte trazoliu,MTT)检测VEGF和L-蛋氨酸对细胞活力的影响,EdU核酸标记技术检测VEGF和L-蛋氨酸对细胞增殖的影响;根据GenBank公布的山羊PCNA、K10和FGF5基因cDNA序列设计引物,通过实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,q-PCR)技术检测上述三个基因在次级毛囊外根鞘细胞中的表达情况。主要研究结果如下:1.成功培养出了陕北白绒山羊初、次级毛囊外根鞘细胞,并利用细胞免疫荧光的方法检测到初级外根鞘细胞的标记基因CK17,以及次级毛囊外根鞘细胞的标记基因CK17和CK15,免疫荧光染色结果均呈阳性;对初、次级毛囊外根鞘细胞分别做了生长曲线,均为“S”型,初、次级毛囊外根鞘细胞在形态和体积上存在一定差异。2.在培养液中添加VEGF可以促进绒山羊次级毛囊外根鞘细胞的增殖,抑制细胞的分化,抑制细胞中FGF5基因的表达。当VEGF处理浓度达到100 ng/mL时,细胞活力(48 h)、增殖细胞数以及PCNA mRNA的表达量均达到最高,且均极显著高于对照组(P0.01),细胞活力(24 h)显著高于对照组(P0.05);VEGF处理24 h时的细胞活力和PCNA mRNA表达量的上升趋势高于48 h。随着浓度的增加,VEGF对细胞分化的抑制作用在增强,当浓度为100 ng/mL时,K10 mRNA的表达量最低;随着时间的增加,VEGF对细胞分化的抑制作用在增强,100 ng/mL组处理48 h时的表达量显著低于处理24 h(P0.05)。随着浓度的增加,FGF5 mRNA在100 ng/mL组时表达量最低,并推测VEGF可以通过抑制FGF5的表达促进毛囊生长。3.在培养液中添加L-蛋氨酸抑制绒山羊次级毛囊外根鞘细胞的增殖和分化。处理24 h时,随着浓度的增殖,L-蛋氨酸对细胞增殖的抑制作用在增强,120μg/mL时抑制作用最强,但无显著差异;处理48 h时,随着浓度的增加,L-蛋氨酸对细胞增殖的抑制作用先上升后下降,100μg/mL时抑制作用最为显著,极显著高于对照组(P0.01),而80μg/mL时PCNA mRNA的表达量最低,无显著差异;48 h各组的次级毛囊外根鞘细胞的细胞活力均低于24 h。处理24 h时,随着浓度的增加,K10 mRNA的表达量也呈下降趋势,120μg/mL组表达量最低,无显著差异;处理48 h时,K10 mRNA的表达量也先下降后上升,80μg/mL组表达量最低,无显著差异;过高浓度的L-蛋氨酸(120μg/mL)对次级毛囊外根鞘细胞增殖和分化的抑制效果均有所减弱。综合以上试验结果,表明首次成功的培养出了陕北白绒山羊初、次级毛囊外根鞘细胞;VEGF能够促进次级毛囊外根鞘细胞的增殖,抑制细胞的分化,且抑制次级毛囊外根鞘细胞中FGF5基因的表达;L-蛋氨酸抑制对次级毛囊外根鞘细胞的增殖和分化。
【关键词】：陕北白绒山羊 次级毛囊 外根鞘细胞 VEGF L-蛋氨酸
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S827
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 第一章 毛囊发育研究进展12-22
• 1.1 毛囊的基本结构12-14
• 1.2 毛囊的发育及调控14-16
• 1.3 毛囊的周期及相关分子调控16-18
• 1.4 VEGF在毛囊中作用的研究进展18-19
• 1.5 L-蛋氨酸对毛囊发育的影响19-20
• 1.6 本研究的目的和意义20-22
• 第二章 绒山羊毛囊外根鞘细胞的体外培养22-29
• 2.1 材料与方法22-24
• 2.1.1 材料22-23
• 2.1.2 试验方法23-24
• 2.2 结果与分析24-27
• 2.2.1 绒山羊毛囊外根鞘细胞的体外培养24-25
• 2.2.2 初级毛囊和次级毛囊外根鞘细胞的鉴定25-26
• 2.2.3 初级毛囊和次级毛囊外根鞘细胞生长曲线26-27
• 2.3 讨论27-28
• 2.4 小结28-29
• 第三章 VEGF对次级毛囊外根鞘细胞增殖和分化的影响29-37
• 3.1 材料与方法29-31
• 3.1.1 材料29
• 3.1.2 试验方法29-31
• 3.2 结果分析31-34
• 3.2.1 MTT法检测次级毛囊外根鞘细胞的增殖31
• 3.2.2 EdU检测次级毛囊外根鞘细胞的增殖31-32
• 3.2.3 PCNA、K10基因在次级毛囊外根鞘细胞中的表达32-33
• 3.2.4 FGF5基因在次级毛囊外根鞘细胞中的表达33-34
• 3.3 讨论34-35
• 3.4 小结35-37
• 第四章 L-蛋氨酸对次级毛囊外根鞘细胞增殖和分化的影响37-43
• 4.1 材料与方法37-38
• 4.1.1 材料37
• 4.1.2 试验方法37-38
• 4.2 结果分析38-41
• 4.2.1 MTT法检测次级毛囊外根鞘细胞的增殖38-39
• 4.2.2 EdU检测次级毛囊外根鞘细胞的增殖39-40
• 4.2.3 PCNA、K10基因在次级毛囊外根鞘细胞中的表达40-41
• 4.3 讨论41-42
• 4.4 小结42-43
• 第五章 结论43-44
• 5.1 结论43
• 5.2 创新点43
• 5.3 展望43-44
• 参考文献44-50
• 附录50-53
• 致谢53-54
• 作者简介54

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