快速检测TGEV和PEDV早期感染的UNDP-PCR方法的建立

发布时间：2017-05-21 14:04

  本文关键词：快速检测TGEV和PEDV早期感染的UNDP-PCR方法的建立，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着规模化养猪业的迅速发展,猪病毒性腹泻已成为影响养猪业的主要疫病之一。目前,危害养猪业的猪病毒性腹泻疾病主要以传染性胃肠炎和流行性腹泻为主。而现今常用的检测方法,无法在感染早期检测到这些病毒的存在,使这类疾病缺乏有效监控措施,进而引起地域性的暴发性流行。同时,由于这两种疫病在流行病学特征、临床症状和病理剖检变化等方面高度的相似性,因此它们的鉴别诊断必须借助实验室诊断技术进行。因此,建立超高敏感性的传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的早期检测和鉴别诊断方法,将对于猪病毒性腹泻疾病的综合防控产生重大的意义。本研究拟首先通过系统化筛选TGEV和PEDV特异性的核酸探针,并将优化的TGEV和PEDV探针分别标记于磁性微粒和纳米金颗粒上,用来从疑似感染猪血清或粪便样本中高效富集病毒核酸,形成MMPs-RNA-AuNPs“三明治”样复合物,将微弱病毒核酸信号进一步放大,并利用特殊引物通过PCR检测特异性DNA标签,进而分别建立特异性针对TGEV和PEDV的基于纳米颗粒的超敏检测方法(Ultrasensitive nanoparticle DNA probe-based PCR assay,UNDP-PCR)。在此基础上,进一步建立可同时检测TGEV和PEDV的双重UNDP-PCR检测技术。研究工作取得如下结果:1.建立可从血液样本中检测TGEV的UNDP-PCR检测方法。根据TGEV编码复制酶蛋白的ORF1a基因保守区域,设计6段特异性核酸探针,标记于磁性微粒表面,形成功能化磁珠MMPs-p1到p6。将功能化的磁珠与TGEV RNA在杂交缓冲液中40 oC孵育30 min,磁分离,用TGEV特异性的RT-PCR进行检测。然后将6段探针标记于纳米金颗粒,形成功能化AuNPs-Oligo1到Oligo6,分别与TGEV RNA在50 oC下杂交40 min,离心沉淀后用于TGEV RT-PCR检测。研究结果表明:p1和Oligo2是具有高度特异性,富集病毒能力强、易于扩增和检测的2段探针,因此利用此2段探针分别功能化磁性微粒和纳米金颗粒,建立一种特异性针对TGEV的UNDP-PCR检测方法。研究结果表明:TGEV UNDP-PCR方法的灵敏度为20 copies/mL,是TGEV普通RT-PCR检测方法的250倍;具有很好的重复性和很强的特异性,与其他病毒不会发生交叉反应。2.在TGEV UNDP-PCR检测方法的基础上,经过一定优化和改进,建立了可从粪便样本中检测PEDV的UNDP-PCR检测技术。首先,基于PEDV编码复制酶蛋白基因ORF1a保守区域,依据一系列筛选标准,共设计16段核酸序列。经过探针筛选试验得到最优化的两段探针,分别标记磁性微粒和纳米金颗粒,用于特异性高效富集PEDV RNA。结果显示,该方法灵敏度为25 copies/g,是传统PEDV RT-PCR检测方法的400倍,同时具有很强的特异性和重复性。利用该方法对153例临床粪便样本检测,PEDV UNDP-PCR方法与普通RT-PCR方法的阳性检出率分别为30.72%和5.88%。3.建立可在同一反应体系中对TGEV和PEDV同时进行快速灵敏检测的双重UNDP-PCR检测方法。结果表明,该方法可以检测到25 copies的TGEV和PEDV,其灵敏度是传统双重RT-PCR的400倍。此外该检测系统具有很强的稳定性和特异性。综上所述,本研究建立的TGEV UNDP-PCR检测方法、PEDV UNDP-PCR检测方法以及针对TGEV和PEDV的双重UNDP-PCR检测方法,检测时间进一步缩短,同时与传统的其他检测技术相比,具有灵敏度高、特异性强和重复性好等优点,此技术方法为在临床病变出现前对病原体扩散进行有效控制,减少疫病传播提供了可靠的技术保证。
【关键词】：猪传染性胃肠炎病毒 猪流行性腹泻病毒 纳米颗粒 PCR
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 文献综述13-24
• 第一章 TGEV和PEDV病原特征及检测技术研究概况13-21
• 1.1 猪传染性胃肠炎病毒病原特征13-14
• 1.2 猪流行性腹泻病毒病原特征14-15
• 1.3 TGEV和PEDV检测技术研究概况15-21
• 1.3.1 病毒的分离与鉴定15-16
• 1.3.2 血清学和免疫学方法16-17
• 1.3.3 分子生物学方法17-21
• 第二章 纳米颗粒在病原检测中的应用21-24
• 2.1 磁性微粒（MMPs）21-22
• 2.1.1 理化性质21
• 2.1.2 MMPs在病原检测方面的应用21-22
• 2.2 纳米金颗粒（AuNPs）22
• 2.2.1 理化性质22
• 2.2.2 AuNPs在病原检测方面的应用22
• 2.3 本研究的目的与意义22-24
• 试验研究24-50
• 第三章 TGEV UNDP-PCR检测方法的建立24-35
• 3.1 材料24-25
• 3.1.1 病毒和细胞24-25
• 3.1.2 主要试剂25
• 3.1.3 主要溶液25
• 3.1.4 主要仪器25
• 3.2 方法25-28
• 3.2.1 病毒核酸提取25
• 3.2.2 探针的设计与筛选25-26
• 3.2.3 TGEV特异性探针标记的磁性微粒（MMPs）的制备26-27
• 3.2.4 TGEV特异性功能化纳米金颗粒（AuNPs）的制备27
• 3.2.5 TGEV UNDP-PCR检测流程27
• 3.2.6 TGEV定量载体的构建27-28
• 3.2.7 TGEV定量标准曲线的绘制28
• 3.2.8 TGEV UNDP-PCR检测方法的灵敏度，重复性和特异性28
• 3.3 结果28-33
• 3.3.1 探针的设计与优化28-30
• 3.3.2 TGEV定量质粒标准品的制备30
• 3.3.3 TGEV定量标准曲线的绘制30-31
• 3.3.4 TGEV UNDP-PCR检测方法的灵敏度分析31
• 3.3.5 TGEV UNDP-PCR检测方法的重复性分析31-32
• 3.3.6 TGEV UNDP-PCR检测方法的特异性分析32
• 3.3.7 TGEV UNDP-PCR检测方法临床初步应用32-33
• 3.4 讨论33-34
• 3.5 小结34-35
• 第四章 PEDV UNDP-PCR检测方法的建立35-44
• 4.1 材料35
• 4.1.1 样本35
• 4.1.2 主要试剂35
• 4.1.3 主要仪器35
• 4.2 方法35-37
• 4.2.1 PEDV UNDP-PCR探针的设计与筛选35-37
• 4.2.2 PEDV特异性探针标记的磁性微粒（MMPs）和功能化纳米金颗粒（AuNPs）的制备37
• 4.2.3 PEDV UNDP-PCR检测流程37
• 4.2.4 PEDV定量载体的构建37
• 4.2.5 PEDV定量标准曲线的绘制37
• 4.2.6 PEDV UNDP-PCR检测方法的敏感性，重复性和特异性37
• 4.3 结果37-42
• 4.3.1 PEDV UNDP-PCR方法的优化37-39
• 4.3.2 PEDV定量质粒标准品的制备39
• 4.3.3 PEDV定量标准曲线的绘制39-40
• 4.3.4 PEDV UNDP-PCR检测方法的灵敏度分析40
• 4.3.5 PEDV UNDP-PCR检测方法的重复性分析40-41
• 4.3.6 PEDV UNDP-PCR检测方法的特异性分析41
• 4.3.7 PEDV UNDP-PCR方法临床初步应用41-42
• 4.4 讨论42-43
• 4.5 小结43-44
• 第五章 TGEV和PEDV双重UNDP-PCR检测方法的建立44-50
• 5.1 材料44
• 5.1.1 样本44
• 5.1.2 主要仪器和试剂44
• 5.2 方法44
• 5.2.1 双重UNDP-PCR方法灵敏度44
• 5.2.2 双重UNDP-PCR方法特异性和重复性44
• 5.3 结果44-48
• 5.3.1 双重UNDP-PCR方法的优化44-45
• 5.3.2 双重UNDP-PCR检测方法的灵敏度分析45-46
• 5.3.3 双重UNDP-PCR方法特异性和可重复性分析46-47
• 5.3.4 双重UNDP-PCR方法临床初步应用47-48
• 5.4 讨论48-49
• 5.5 小结49-50
• 结论50-51
• 主要参考文献51-57
• 英文缩略词及中英文对照表57-58
• 致谢58-59
• 作者简介59

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