lncRNA-CEPT8调控鸡原始生殖细胞形成研究
发布时间：2023-08-09 18:16
原始生殖细胞是精子和卵子的祖细胞,具有分化成精原细胞或卵原细胞的潜能。原始生殖细胞(Primordial germ cell,PGC)具有多能性,能分化为精原细胞或卵原细胞最终形成配子。通过对原始生殖细胞由浅入深的逐渐探索,其在动物遗传领域和生殖医学领域的价值越来越重要。研究原始生殖细胞有助于揭示生殖细胞发生发育过程中相关基因作用机制和表观遗传学修饰调控机制,为生产转基因动物提供材料,也辅助指导生殖疾病的相关研究;然而,目前对原始生殖细胞的形成机制的研究尚不完全清楚,难以在体外诱导获得大量的原始生殖细胞,阻碍了其在动物遗传学和生殖医学领域的应用。近年来,随着测序技术的发展人们对表观遗传学修饰有了更全面的认识,其中lncRNA与雄性生殖方面的研究尤为受到关注。研究表明在雄性哺乳动物的睾丸组织中存在着大量特异性表达的lncRNA,其中多条lncRNA与精子发生紧密相关,并且在雄性生殖细胞增殖、分化的过程中起到重要调控作用。由于PGC细胞是精子的祖细胞,所以推测lncRNA对PGC的形成和分化起关键调控作用。然而目前针对lncRNA与生殖过程相关的研究主要集中在哺乳动物或果蝇,斑马鱼等模式生...
【文章页数】：91 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRCAT
缩略词表
第一章 文献综述
1 原始生殖细胞
1.1 原始生殖细胞的生物学特性
1.2 原始生殖细胞研究进展
1.2.1 多细胞因子参与调控原始生殖细胞形成
1.2.2 多信号通路参与调控生殖细胞形成
1.2.3 JAK/STAT信号通路调控生殖细胞形成
2 lncRNA与雄性生殖细胞
2.1 表观遗传与雄性生殖细胞
2.2 lncRNA与精子发生
2.3 lncRNA与精子成熟
2.4 lncRNA在生物性腺和性染色体中的功能
3 研究目的及意义
4 参考文献
第二章 lncRNA-CEPT8的鉴定及理化性质分析
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
1.1.1 材料
1.1.2 主要仪器设备
1.2 方法
1.2.1 鸡生殖嵴总RNA提取
1.2.2 如皋黄鸡生殖嵴cDNA库的建立
1.2.3 RACE实验
1.2.4 鸡原始生殖细胞分离纯化
1.2.5 亚细胞定位
1.2.6 原核融合表达载体构建
1.2.7 菌液蛋白提取
1.2.8 Western Blot检测蛋白表达
1.3 统计分析
2 结果
2.1 lncRNA-CEPT8在不同组织和细胞中的表达差异
2.2 lncRNA-CEPT8编码能力鉴定
2.2.1 lncRNA-CEPT8亚细胞定位
2.2.2 lncRNA-CEPT8开放阅读框预测
2.2.3 lncRNA-CEPT8原核融合表达载体构建
2.2.4 Western Blot检测lncRNA-CEPT8编码小肽能力
3 讨论
4 小结
5 参考文献
第三章 lncRNA-CEPT8调节鸡PGC生成的生物学功能研究
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
1.1.1 材料
1.1.2 主要仪器设备
1.2 方法
1.2.1 lncRNA-CEPT8干扰靶位点选择与干扰载体构建
1.2.2 lncRNA-CEPT8过量表达载体构建
1.2.3 干扰和过表达载体活性检测
1.2.4 鸡胚体干细胞分离培养
1.2.5 体内研究lncRNA-CEPT8在PGC形成中的功能
1.2.6 体外研究lncRNA-CEPT8在PGC形成中的功能
2 结果
2.1 lncRNA-CEPT8干扰与过表达载体构建及活性检测
2.2 体内研究检测lncRNA-CEPT8在PGC形成中的功能
2.2.1 qRT-PCR检测不同lncRNA-CEPT8表达水平下PGC标记基因表达变化
2.2.2 流式细胞分析检测PGC形成效率
2.2.3 免疫组织化学染色观察PGC形成效率
2.3 体外研究lncRNA-CEPT8在PGC形成中的功能
2.3.1 不同lncRNA-CEPT8表达水平下类PGC形成细胞形态学观察
2.3.2 qRT-PCR检测PGC标记基因差异表达
2.3.3 流式细胞分析检测类PGC形成效率
2.3.4 间接免疫荧光实验观察第四天CvhC-kit蛋白表达变化
3 讨论
4 小结
5 参考文献
第四章 lncRNA-CEPT8调节靶基因Trim8表达影响鸡原始生殖细胞形成机制初探
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
1.1.1 材料
1.1.2 主要仪器设备
1.2 方法
1.2.1 鸡生殖嵴总RNA提取
1.2.2 RT-PCR检测不同lncRNA-CEPT8表达水平下Trim8基因表达变化
1.3 Trim8干扰及过表达载体构建
1.4 干扰载体及过表达载体活性检测
1.5 体内实验研究Trim8在PGC形成中的功能
1.5.1 鸡胚血管注射
1.5.2 流式细胞分析检测PGC形成效率
1.5.3 RT-PCR检测PGC标记基因表达变化
1.6 体外实验检测验证Trim8基因功能
1.6.1 鸡胚干细胞体外诱导培养
1.6.2 RT-PCR检测PGC标记基因表达水平
1.6.3 流式细胞分析检测PGC形成效率
1.7 RT-PCR检测STAT信号通路标记基因STAT3和JAK2表达量
2 结果
2.1 RT-PCR检测Trim8在lncRNA-CEPT8不同表达水平下基因表达量变化
2.2 Trim8干扰与过表达载体构建及活性检测
2.3 体内研究检测Trim8在PGC形成中的功能
2.3.1 qRT-PCR检测不同lncRNA-CEPT8表达水平下PGC标记基因表达变化
2.3.2 流式细胞分析检测PGC形成效率
2.4 体外研究lncRNA-CEPT8在PGC形成中的功能
2.4.1 不同lncRNA-CEPT8表达水平下类PGC形成细胞形态学观察
2.4.2 流式细胞分析检测PGC形成效率
2.4.3 qRT-PCR检测不同lncRNA-CEPT8表达水平下PGC标记基因表达变化
2.5 RT-PCR检测STAT信号通路标记基因差异表达
3 讨论
4 小结
5 参考文献
第五章 启动子调控lncRNA-CEPT8表达影响初步探究
1 材料和方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.1 lncRNA-CEPT8启动子区域生物信息学分析
1.2.2 全基因组提取
1.2.3 真核表达载体pEGFP-CEPT8及逐段截取各启动子片段载体构建
1.2.4 lncRNA-CEPT8启动子关键调控区域鉴定
1.2.5 启动子关键正向调控区域转录因子预测
1.2.6 转录因子影响lncRNA-CEPT8表达水平
2 结果
2.1 真核表达载体pEGFP-CEPT8与启动子逐段截取片段载体构建
2.2 lncRNA-CEPT8启动子活性定性分析
2.3 lncRNA-CEPT8启动子关键正向调控区域确定及转录因子结合位点预测
2.4 转录因子PAX2,PAX5及KLF4点突变载体构建及活性检测
2.5 添加甲基化/乙酰化抑制剂对lncRNA-CEPT8启动子区影响
3 讨论
4 小结
5 参考文献
全文结论与创新
全文结论
全文创新点
有待改进之处
致谢
研究生期间发表的论文
附录
本文编号：3840723
【文章页数】：91 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRCAT
缩略词表
第一章 文献综述
1 原始生殖细胞
1.1 原始生殖细胞的生物学特性
1.2 原始生殖细胞研究进展
1.2.1 多细胞因子参与调控原始生殖细胞形成
1.2.2 多信号通路参与调控生殖细胞形成
1.2.3 JAK/STAT信号通路调控生殖细胞形成
2 lncRNA与雄性生殖细胞
2.1 表观遗传与雄性生殖细胞
2.2 lncRNA与精子发生
2.3 lncRNA与精子成熟
2.4 lncRNA在生物性腺和性染色体中的功能
3 研究目的及意义
4 参考文献
第二章 lncRNA-CEPT8的鉴定及理化性质分析
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
1.1.1 材料
1.1.2 主要仪器设备
1.2 方法
1.2.1 鸡生殖嵴总RNA提取
1.2.2 如皋黄鸡生殖嵴cDNA库的建立
1.2.3 RACE实验
1.2.4 鸡原始生殖细胞分离纯化
1.2.5 亚细胞定位
1.2.6 原核融合表达载体构建
1.2.7 菌液蛋白提取
1.2.8 Western Blot检测蛋白表达
1.3 统计分析
2 结果
2.1 lncRNA-CEPT8在不同组织和细胞中的表达差异
2.2 lncRNA-CEPT8编码能力鉴定
2.2.1 lncRNA-CEPT8亚细胞定位
2.2.2 lncRNA-CEPT8开放阅读框预测
2.2.3 lncRNA-CEPT8原核融合表达载体构建
2.2.4 Western Blot检测lncRNA-CEPT8编码小肽能力
3 讨论
4 小结
5 参考文献
第三章 lncRNA-CEPT8调节鸡PGC生成的生物学功能研究
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
1.1.1 材料
1.1.2 主要仪器设备
1.2 方法
1.2.1 lncRNA-CEPT8干扰靶位点选择与干扰载体构建
1.2.2 lncRNA-CEPT8过量表达载体构建
1.2.3 干扰和过表达载体活性检测
1.2.4 鸡胚体干细胞分离培养
1.2.5 体内研究lncRNA-CEPT8在PGC形成中的功能
1.2.6 体外研究lncRNA-CEPT8在PGC形成中的功能
2 结果
2.1 lncRNA-CEPT8干扰与过表达载体构建及活性检测
2.2 体内研究检测lncRNA-CEPT8在PGC形成中的功能
2.2.1 qRT-PCR检测不同lncRNA-CEPT8表达水平下PGC标记基因表达变化
2.2.2 流式细胞分析检测PGC形成效率
2.2.3 免疫组织化学染色观察PGC形成效率
2.3 体外研究lncRNA-CEPT8在PGC形成中的功能
2.3.1 不同lncRNA-CEPT8表达水平下类PGC形成细胞形态学观察
2.3.2 qRT-PCR检测PGC标记基因差异表达
2.3.3 流式细胞分析检测类PGC形成效率
2.3.4 间接免疫荧光实验观察第四天CvhC-kit蛋白表达变化
3 讨论
4 小结
5 参考文献
第四章 lncRNA-CEPT8调节靶基因Trim8表达影响鸡原始生殖细胞形成机制初探
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
1.1.1 材料
1.1.2 主要仪器设备
1.2 方法
1.2.1 鸡生殖嵴总RNA提取
1.2.2 RT-PCR检测不同lncRNA-CEPT8表达水平下Trim8基因表达变化
1.3 Trim8干扰及过表达载体构建
1.4 干扰载体及过表达载体活性检测
1.5 体内实验研究Trim8在PGC形成中的功能
1.5.1 鸡胚血管注射
1.5.2 流式细胞分析检测PGC形成效率
1.5.3 RT-PCR检测PGC标记基因表达变化
1.6 体外实验检测验证Trim8基因功能
1.6.1 鸡胚干细胞体外诱导培养
1.6.2 RT-PCR检测PGC标记基因表达水平
1.6.3 流式细胞分析检测PGC形成效率
1.7 RT-PCR检测STAT信号通路标记基因STAT3和JAK2表达量
2 结果
2.1 RT-PCR检测Trim8在lncRNA-CEPT8不同表达水平下基因表达量变化
2.2 Trim8干扰与过表达载体构建及活性检测
2.3 体内研究检测Trim8在PGC形成中的功能
2.3.1 qRT-PCR检测不同lncRNA-CEPT8表达水平下PGC标记基因表达变化
2.3.2 流式细胞分析检测PGC形成效率
2.4 体外研究lncRNA-CEPT8在PGC形成中的功能
2.4.1 不同lncRNA-CEPT8表达水平下类PGC形成细胞形态学观察
2.4.2 流式细胞分析检测PGC形成效率
2.4.3 qRT-PCR检测不同lncRNA-CEPT8表达水平下PGC标记基因表达变化
2.5 RT-PCR检测STAT信号通路标记基因差异表达
3 讨论
4 小结
5 参考文献
第五章 启动子调控lncRNA-CEPT8表达影响初步探究
1 材料和方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.1 lncRNA-CEPT8启动子区域生物信息学分析
1.2.2 全基因组提取
1.2.3 真核表达载体pEGFP-CEPT8及逐段截取各启动子片段载体构建
1.2.4 lncRNA-CEPT8启动子关键调控区域鉴定
1.2.5 启动子关键正向调控区域转录因子预测
1.2.6 转录因子影响lncRNA-CEPT8表达水平
2 结果
2.1 真核表达载体pEGFP-CEPT8与启动子逐段截取片段载体构建
2.2 lncRNA-CEPT8启动子活性定性分析
2.3 lncRNA-CEPT8启动子关键正向调控区域确定及转录因子结合位点预测
2.4 转录因子PAX2,PAX5及KLF4点突变载体构建及活性检测
2.5 添加甲基化/乙酰化抑制剂对lncRNA-CEPT8启动子区影响
3 讨论
4 小结
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全文结论与创新
全文结论
全文创新点
有待改进之处
致谢
研究生期间发表的论文
附录
本文编号：3840723
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