新城疫病毒NDV4-C株反向遗传操作系统的建立及耐热应用研究

发布时间：2023-08-25 22:55

　　新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的急性、高度接触性的禽类传染病，给世界养禽业造成极大的经济损失。目前，疫苗接种仍然是预防和控制该病普遍采用的方法。 NDV4是广泛应用于东南亚和非洲等热带亚热带地区的一种耐热疫苗株，具有耐热性和免疫持续期长等优点。NDV4-C株是V4疫苗株在SPF鸡胚上连续传代筛选获得的一株耐热无毒株，目前NDV4毒株的研究相对滞后，一个主要的原因是反向遗传操作系统平台尚未建立，相应的耐热性和免疫原性研究也鲜有报道。为此，本研究以NDV4-C株为研究对象，在对NDV4-C株全基因组序列系统解析的基础上，首次建立了分别以T7启动子和CMV启动子的NDV4-C株反向遗传操作系统，拯救病毒rNDV4-C (T7)和rNDV4-C (CMV)的耐热性和生物学特性均与亲本毒株相似。同时，为了评估NDV4-C株作为载体的可行性，构建了表达增强型绿色荧光蛋白的重组新城疫病毒rNDV4-eGFP，其在SPF鸡胚上生长特性与亲本病毒相似，重组病毒能够稳定表达增强型绿色荧光蛋白至少15代，结果...

【文章页数】：81 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 新城疫概况
        1.1.1 新城疫
        1.1.2 新城疫病毒的形态和基因组结构
        1.1.3 新城疫病毒的复制策略
        1.1.4 新城疫病毒的生物学特性
        1.1.5 新城疫病毒 NDV4 疫苗株概况
    1.2 反向遗传操作系统
        1.2.1 新城疫病毒的反向遗传操作系统
        1.2.2 新城疫病毒反向遗传操作系统的基础应用研究
    1.3 本研究的目的和意义
第二章 NDV4-C 耐热无毒株反向遗传操作系统的建立
    2.1 材料和方法
        2.1.1 病毒和细胞
        2.1.2 质粒、菌株和合成基因
        2.1.3 SPF 鸡胚和 SPF 鸡
        2.1.4 主要试剂和仪器
        2.1.5 引物设计与合成
        2.1.6 病毒的纯化
        2.1.7 病毒 RNA 的提取、反转录和 RT-PCR
        2.1.8 PCR 产物的测序
        2.1.9 辅助质粒和微基因组质粒的构建
        2.1.10 以 pOLTV5 为载体的全长 cDNA 克隆的构建
        2.1.11 以 pCI-neo 为载体的全长 cDNA 克隆的构建
        2.1.12 微基因组系统的功能验证
        2.1.13 病毒的拯救
        2.1.14 间接免疫荧光检测拯救病毒
        2.1.15 拯救病毒的序列鉴定和酶切鉴定
        2.1.16 拯救病毒的特性及致病性实验
        2.1.17 拯救病毒的生长动力学曲线
        2.1.18 拯救病毒的耐热性测定
    2.2 结果
        2.2.1 NDV4-C 全长基因组序列的测序和扩增
        2.2.2 NDV4-C 基因组全长 cDNA 克隆和辅助质粒的构建
        2.2.3 微基因组系统的功能验证
        2.2.4 拯救病毒的鉴定
        2.2.5 间接免疫荧光鉴定
        2.2.6 拯救病毒的致病性测定
        2.2.7 拯救病毒的生长动力学曲线
        2.2.8 拯救病毒的耐热性测定
        2.2.9 核酸序列号
    2.3 讨论
第三章 表达绿色荧光蛋白重组 NDV 的构建和生物学特性研究
    3.1 材料和方法
        3.1.1 病毒、质粒和细胞
        3.1.2 SPF 鸡胚
        3.1.3 主要试剂和仪器
        3.1.4 引物设计与合成
        3.1.5 含有 eGFP 基因重组 NDV4-C 病毒全长 cDNA 克隆的构建
        3.1.6 重组病毒 rNDV4-eGFP 的拯救
        3.1.7 rNDV4-eGFP 的序列鉴定
        3.1.8 rNDV4-eGFP 感染细胞的荧光鉴定
        3.1.9 拯救病毒表达外源基因稳定性的测定
        3.1.10 拯救病毒的生长动力学曲线
    3.2 结果
        3.2.1 含有 eGFP 基因的重组 NDV4-C 基因组全长 cDNA 克隆的构建
        3.2.2 重组病毒的拯救
        3.2.3 重组病毒表达外源基因稳定性的鉴定
        3.2.4 重组病毒在鸡胚上的生长特性
    3.3 讨论
第四章 聚合酶蛋白对 NDV4-C 耐热性的作用研究
    4.1 材料和方法
        4.1.1 病毒、质粒和细胞
        4.1.2 SPF 鸡胚
        4.1.3 主要试剂和仪器
        4.1.4 引物设计与合成
        4.1.5 嵌合病毒全长基因组 cDNA 克隆的构建
        4.1.6 突变病毒和嵌合病毒的拯救
        4.1.7 拯救病毒毒力的测定
        4.1.8 病毒生长动力学曲线的测定
        4.1.9 病毒耐热性的测定
        4.1.10 病毒微基因组质粒的构建
        4.1.11 聚合酶蛋白活性的测定
    4.2 结果
        4.2.1 重组嵌合病毒基因组全长 cDNA 克隆的构建
        4.2.2 亲本病毒和重组病毒的拯救
        4.2.3 拯救病毒的毒力
        4.2.4 拯救病毒的生长动力学
        4.2.5 拯救病毒的耐热性测定
        4.2.6 表达荧光素酶的微基因组质粒构建
        4.2.7 聚合酶活性测定
    4.3 讨论
第五章 rNDV4-LL01(F/HN) 耐热嵌合病毒株的构建和免疫评价
    5.1 材料和方法
        5.1.1 病毒、质粒和细胞
        5.1.2 SPF 鸡胚和 SPF 鸡
        5.1.3 主要试剂和仪器
        5.1.4 引物设计与合成
        5.1.5 嵌合病毒全长基因组 cDNA 克隆的构建
        5.1.6 突变病毒和嵌合病毒的拯救
        5.1.7 嵌合病毒毒力的测定
        5.1.8 病毒生长动力学曲线的测定
        5.1.9 病毒耐热性的测定
        5.1.10 免疫攻毒试验
        5.1.11 HI 抗体和 IgG 抗体的检测
        5.1.12 间接 ELISA 测定 IgA 抗体水平
        5.1.13 SPF 鸡的排毒情况
        5.1.14 数据处理和分析
    5.2 结果
        5.2.1 突变病毒和嵌合病毒的拯救和鉴定
        5.2.2 突变病毒和嵌合病毒的毒力测定
        5.2.3 突变病毒和嵌合病毒在 SPF 鸡胚上的生长特性
        5.2.4 突变病毒和嵌合病毒的耐热性
        5.2.5 交叉血凝抑制试验 (cross-HI)测定免疫组的 HI 滴度
        5.2.6 免疫组 IgG 抗体水平的测定
        5.2.7 免疫组 IgA 抗体水平的测定
        5.2.8 不同免疫组的免疫保护力和排毒情况
        5.2.9 rNDV4-MuF/HNLL01 免疫组排毒量较 rNDV4-C 免疫组显著降低
    5.3 讨论
第六章 全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简历



本文编号：3843462