单增李斯特菌ΔinlABJ缺失株构建及炎性因子对小鼠血脑屏障损伤作用研究

发布时间：2023-08-26 01:34

　　目的:本研究以临床分离的致绵羊脑炎单增李斯特菌(Lm90)为材料,在inlA、inlB缺失基础上缺失inlJ构建三基因缺失株(Lm90-ΔinlABJ),分析其部分生物学特性及对小鼠和绵羊的致病作用;应用Lm90感染小鼠,分析小鼠血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)通透性变化及发生损伤的可能作用机制,并构建体外BBB模型进一步验证炎性因子对小鼠BBB损伤的影响作用,为进一步研究单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,L.monocytogenes)的致病机理及防控李斯特菌病提供参考,也为进一步开展其它细菌性脑膜炎病原菌感染中枢神经系统的研究提供一定借鉴。方法:(1)用Primer 5.0软件设计引物,PCR扩增inlJ基因上、下游同源臂,采用重叠延伸PCR获得缺失inlJ的融合片段ΔinlJ;构建重组穿梭质粒pKSV7-ΔinlJ,经电转化至Lm90-ΔinlAB感受态细胞,在温度及氯霉素双重压力下实现同源重组;筛选重组Lm90-ΔinlABJ,并检测其遗传稳定性。(2)采用细菌学方法对比分析Lm90-ΔinlABJ、Lm90-ΔinlAB及L...

【文章页数】：120 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩略词
第一章 绪论
    1 研究目的及意义
    2 国内外研究进展
        2.1 单增李斯特菌概述
        2.2 单增李斯特菌的生物学特性
        2.3 单增李斯特菌的致病力
        2.4 单增李斯特菌感染的致病机理
        2.5 单增李斯特菌的毒力因子及调控因子
        2.6 单增李斯特菌侵染中枢神经系统研究进展
    3 研究内容与技术路线
        3.1 主要研究内容
        3.2 技术路线
第二章 试验研究
    试验一 单增李斯特菌ΔinlABJ缺失株的构建
        前言
        1 材料
            1.1 菌株及质粒
            1.2 主要试剂
            1.3 主要仪器设备
            1.4 引物设计
        2 方法
            2.1 inlJ上、下游同源臂的扩增及融合
            2.2 inlJ缺失片段的克隆与测序
            2.3 重组穿梭质粒pKSV7-ΔinlJ的构建
            2.4 Lm90-ΔinlAB感受态细胞的制备
            2.5 电转化及Lm90-ΔinlABJ缺失株的筛选与鉴定
        3 结果
            3.1 inlJ基因上下游臂的扩增及SOE-PCR结果
            3.2 重组质粒pKSV7-ΔinlJ的双酶切鉴定
            3.3 电转后阳性转化子筛选与鉴定
            3.4 同源重组子的筛选与鉴定
            3.5 缺失株的遗传稳定性鉴定
        4 讨论
        5 小结
    试验二 单增李斯特菌Δinl ABJ缺失株部分生物学特性研究
        前言
        1 材料
            1.1 菌株、细胞及实验动物
            1.2 主要试剂
            1.3 主要仪器设备
        2 方法
            2.1 缺失株培养特性及生长曲线测定
            2.2 缺失株溶血特性测定
            2.3 细胞黏附、侵袭及胞内增殖能力测定
            2.4 小鼠存活试验
            2.5 半数致死量(LD50)测定
            2.6 小鼠组织载菌量测定
            2.7 绵羊感染试验
            2.8 数据分析
        3 结果
            3.1 培养特性
            3.2 生长曲线测定
            3.3 溶血测定
            3.4 细胞侵袭及胞内增殖
            3.5 缺失株对小鼠的毒力试验
            3.6 小鼠LD50测定
            3.7 小鼠组织载菌量测定
            3.8 绵羊感染试验结果
        4 讨论
        5 小结
    试验三 单增李斯特菌对小鼠血脑屏障损伤及其可能机制研究
        前言
        1 材料
            1.1 菌株及实验动物
            1.2 主要实验器材
            1.3 主要试剂
            1.4 主要试剂的配制
        2 方法
            2.1 小鼠感染试验
            2.2 感染小鼠BBB通透性测定
            2.3 脑组织取材、固定及切片制作
            2.4 HE染色及免疫组化
            2.5 组织样品RNA、蛋白提取
            2.6 cDNA模板制备
            2.7 SYBR Green法荧光定量PCR
            2.8 蛋白质免疫印迹
            2.9 细胞因子测定
            2.10 统计学分析
        3 结果与分析
            3.1 不同感染剂量小鼠存活率
            3.2 感染小鼠眼观症状
            3.3 小鼠脑组织细菌回收及鉴定
            3.4 小鼠脑病理组织学观察
            3.5 小鼠脑组织载菌量测定
            3.6 感染小鼠BBB通透性变化
            3.7 ZO-1、Occludin、Claudin-5 表达变化
            3.8 ZO-1、Occludin、Claudin-5 免疫组化测定
            3.9 单增李斯特菌感染促进TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白水平表达
        4 讨论
        5 小结
    试验四 炎性因子对体外血脑屏障模型损伤的影响作用研究
        前言
        1 材料
            1.1 菌株及细胞
            1.2 主要试验器材
            1.3 实验试剂
            1.4 主要试剂的配制
        2 方法
            2.1 脑微血管内皮细胞及星型胶质细胞的分离培养
            2.2 脑微血管内皮细胞及星型胶质细胞的免疫荧光鉴定
            2.3 体外血脑屏障模型的构建
            2.4 体外血脑屏障模型的评估
            2.5 WB检测体外血脑屏障模型紧密连接蛋白表达
            2.6 小鼠巨噬细胞复苏及培养
            2.7 单增李斯特菌感染RAW264.7 细胞
            2.8 qRT-PCR检测细胞因子的表达
            2.9 ELISA检测细胞因子的表达
            2.10 单增李斯特菌感染RAW264.7 细胞后上清制备
            2.11 感染单增李斯特菌的RAW264.7 细胞产物对BBB通透性的影响
            2.12 统计学分析
        3 结果与分析
            3.1 鼠脑微血管内皮细胞及星型胶质细胞形态学观察
            3.2 鼠脑微血管内皮细胞及星型胶质细胞免疫荧光鉴定
            3.3 跨内皮细胞间电阻(TEER)测定
            3.4 液面试漏试验
            3.5 辣根过氧化物酶(HRP)通透性测定
            3.6 紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5 的表达
            3.7 单增李斯特菌感染可诱导RAW264.7 细胞炎性因子的表达
            3.8 感染单增李斯特菌的RAW264.7 细胞产物可影响BBB的通透性
            3.9 感染单增李斯特菌的RAW264.7 细胞产物可调节BMECs紧密连接蛋白的表达
        4 讨论
        5 小结
第三章 结论
第四章 创新点
参考文献
致谢
作者简介
石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表



本文编号：3843694