CRISPR/Cas9系统对绵羊MSTN基因编辑的研究

发布时间：2023-12-02 09:05

　　目的:肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN),又称生长分化因子8(growth differentiation factor 8,GDF-8),是TGF-β超家族成员之一。MSTN是肌细胞生长发育的负调控因子,MSTN基因变异可引起动物的“双肌”性状,从而提高动物的产肉性能。CRISPR/Cas9系统是近几年研究较多的基因编辑工具,其具有构建简单、打靶效率高、使用成本低等优点,可在较短时间内完成各种复杂的基因定点修饰。本研究利用CRISPR/Cas9系统,选择绵羊MSTN基因第三外显子作为靶位点,设计sgRNA和ssDNA,开展绵羊MSTN基因定点编辑研究,为获得MSTN基因定向诱变的转基因肉羊研究工作奠定基础。方法:实验一,采用Gibson Assembly方法将串联表达原件2A和绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)序列插入pX330质粒,构建pX330-EGFP质粒。再将12对sgRNA寡核苷酸链以Golden Gate方法插入pX330-EGFP质粒,构建pX330-EGFP-sgRNA质粒。实验二:利用电转染方法...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略词表
前言
第一章 文献综述
    第一节 MSTN(MYOSTATIN)基因的研究进展
        1 MSTN的发现
        2 MSTN基因结构与特征
        3 MSTN结构与功能
        4 MSTN基因的研究意义
        5 MSTN的应用前景
    第二节 CRISPR/Cas9基因编辑系统
        1 CRISPR的研究历史
        2 CRISPR/Cas系统分类
        3 CRISPR/Cas9的基因座结构
        4 CRISPR/Cas9系统的作用机制与构建
        5 CRISPR/Cas9系统的研究进展
第二章 试验研究
    试验一 MSTN基因靶点确定及相关质粒构建
        1 材料与方法
            1.1 试剂与仪器
            1.2 试验方法
                1.2.1 sgRNA及检测引物的设计
                1.2.2 pX330-EGFP质粒构建
                1.2.3 pX330-EGFP-sgRNA质粒构建
                1.2.4 pX330-EGFP及pX330-EGFP-SgRNA质粒的转化
                1.2.5 pX330-EGFP-SgRNA去内毒素质粒的提取
        2 结果与分析
        3 讨论
        4 结论
    试验二 高效靶向绵羊MSTN基因sgRNA的筛选
        1 材料和方法
            1.1 试剂和仪器
                1.1.1 细胞与质粒
                1.1.2 主要试剂
                1.1.3 主要仪器
            1.2 试验方法
                1.2.1 绵羊成纤维细胞的培养
                1.2.2 电转液的配制
                1.2.3 电转染细胞
                1.2.4 SURVEYOR检测
                1.2.5 测序鉴定
        2 结果
            2.1 pX330-EGFP-sgRNA载体转染绵羊成纤维细胞
            2.2 SURVEYOR分析
            2.3 测序结果
        3 讨论
        4 结论
    试验三 sgRNA及Cas9蛋白显微注射浓度的优化
        1 材料和方法
            1.1 试剂与仪器
            1.2 试剂的配置
            1.3 方法
                1.3.1 卵母细胞的采集
                1.3.2 卵母细胞的成熟
                1.3.3 卵母细胞的孤雌激活
                1.3.4 孤雌激活卵母细胞的显微注射
                1.3.5 测序鉴定
        2 结果
            2.1 测序分析
        3 讨论
        4 结论
    试验四 CRISPR/Cas9系统介导的同源指导修复效率的验证
        1 材料和方法
            1.1 试剂与仪器
            1.2 方法
                1.2.1 寡核苷酸链(ssDNA)的设计
                1.2.2 卵母细胞的采集
                1.2.3 卵母细胞的处理与成熟
                1.2.4 卵母细胞的体外受精
                1.2.5 受精卵的显微注射
                1.2.6 测序检测
                1.2.7 酶切检测
        2 结果
            2.1 优化方案编辑效果在受精卵上的验证
            2.2 酶切检测结果
        3 讨论
        4 结论
全文结论
创新点
参考文献
附录
致谢
作者简介
附件



本文编号：3869349