兔类ES细胞的分离培养及定向分化的研究

发布时间：2023-12-13 17:58

　　本研究采用兔胚胎作为试验对象，从中分离克隆出兔类ES细胞，而且系统地比较了不同的培养条件对兔类ES细胞分离培养的影响，并对其进行了传代培养及鉴定；采用不同浓度的视黄酸(retinoic acid, RA)对分离到的兔类ES细胞向原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)诱导分化效果进行了初步探讨，为兔胚胎干细胞的建系及向原始生殖细胞的体外分化研究奠定了基础。试验主要结果如下： 1.探讨超数排卵对兔胚胎体外发育能力的影响，收集自然发情和超数排卵处理配种后4d的胚胎，接种于MEF饲养层上培养，以自然发情交配所得兔囊胚作为对照。结果如下：超数排卵组的胚胎贴壁率、ICM形成率和F1代形成率高于自然发情组，但没有显著差异(P>0.05)，兔超数排卵对兔胚胎的体外发育能力没有显著影响。但在干细胞克隆传代方面差异显著(P<0.05)。因此，为保证试验的效率，尤其在严寒和酷热的环境下，兔子自然交配不易成功，对母兔采取超排方式可获得足够的胚胎，但在春秋季节时获得胚胎以自然发情交配为好，其胚胎更适宜分离胚胎干细胞。 2.探讨兔胚胎的不同处理对兔胚胎克隆、传代的影响。将...

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致谢
摘要
第一章 文献综述
    1 胚胎癌细胞的研究概况
    2 胚胎干细胞的研究进展
    3 小鼠 ES 细胞的研究进展
    4 人胚胎干细胞的研究概况
    5 从原始生殖细胞中分离多能性细胞系
    6 胚胎干细胞生物学特性
        6.1 胚胎干细胞的形态
        6.2 胚胎干细胞的多能性
        6.3 胚胎干细胞表面抗原标志
        6.4 维持胚胎干细胞生物学特性的分子机制及相关信号转导通路
            6.4.1 LIF 信号通路对 ESCs 多能性的维持
            6.4.2 Nanog 对 ESCs 多能性的维持
            6.4.3 BMP 信号通路对 ESCs 多能性的维持
            6.4.4 Wnt 通路对 ESCs 多能性的维持
            6.4.5 Oct-4 与 ESCs 多能性的维持
    7 ES 细胞分离培养的影响因素
        7.1 胚胎质量及胚胎类型
        7.2 饲养层对 ES 细胞分离培养的影响
        7.3 培养基对 ES 细胞分离培养的影响
        7.4 添加物对 ES 细胞分离培养的影响
            7.4.1 血清
            7.4.2 其他添加剂
        7.5 ES 细胞传代时间及消化液的影响
    8 ES 细胞的鉴定方法
        8.1 碱性磷酸酶活性鉴定
        8.2 转录因子 Oct-4 及 Nanog 的表达检测
        8.3 核型分析
        8.4 体内分化能力鉴定
        8.5 体外分化能力鉴定
        8.6 嵌合体实验鉴定
    9 ES 细胞体外分化的研究现状
        9.1 ES 细胞分化为造血细胞
        9.2 ES 细胞分化为神经细胞
        9.3 ES 细胞分化为肝细胞
        9.4 ES 细胞分化为心肌细胞
        9.5 ES 细胞分化为胰岛细胞
        9.6 ES 细胞向雄性生殖细胞的分化
    10 ES 细胞的应用前景
    11 ES 细胞研究面临的难题与挑战
第二章 兔类 ES 细胞体外培养体系的优化及鉴定
    1 引言
    2 材料与方法
        2.1 试验材料
            2.1.1 试验动物
            2.1.2 主要试剂
            2.1.3 主要仪器设备
        2.2 主要溶液的配制
            2.2.1 丝裂霉素-C
            2.2.2 1 mol/L β-巯基乙醇存储液
            2.2.3 0.2 mol/L L-谷氨酰胺存储液
            2.2.4 0.2%TritonX-100
            2.2.5 细胞消化液 A:0.05%胰酶+0.02% EDTA 消化液
            2.2.6 细胞消化液 B:0.25%胰酶+0.04% EDTA 消化液
            2.2.7 PMSG 注射液
            2.2.8 hCG 注射液
            2.2.9 4%多聚甲醛
            2.2.10 高糖 DMEM 培养液
            2.2.11 MEF 培养液
            2.2.12 兔类 ES 细胞培养液
            2.2.13 MEF 冻存液
        2.3 试验方法
            2.3.1 小鼠胎儿成纤维细胞的分离培养
            2.3.2 小鼠胎儿成纤维细胞的传代培养
            2.3.3 小鼠胎儿成纤维细胞的冻存与复苏
            2.3.4 MEF 饲养层的制备
            2.3.5 细胞计数
            2.3.6 兔胚胎的获取与处理
                2.3.6.1 兔胚胎的获取
                2.3.6.2 兔胚胎的处理
            2.3.7 兔类 ES 细胞分离与传代
                2.3.7.1 ICM 的培养
                2.3.7.2 兔类 ES 细胞的传代
                2.3.7.3 兔类 ES 细胞在不同培养基上生长传代情况
            2.3.8 兔类 ES 细胞的鉴定
                2.3.8.1 形态学观察
                2.3.8.2 碱性磷酸酶染色
                2.3.8.3 免疫荧光染色
                2.3.8.4 体外分化潜能
                2.3.8.5 对多能性基因 Sox2、Nanog、GAPDH mRNA 的表达进行 RT-PCR 检测
                2.3.8.6 数据统计
    3 结果与分析
        3.1 超排对兔胚胎贴壁和兔类 ES 细胞克隆的影响
        3.2 胚胎的不同处理方式对兔类 ES 细胞分离培养的影响
        3.3 兔类 ES 细胞在不同培养基上的生长与传代情况
        3.4 兔类 ES 细胞经不同传代方法后的生长传代情况
        3.5 兔类 ES 细胞的鉴定
            3.5.1 形态结构的鉴定
            3.5.2 碱性磷酸酶鉴定
            3.5.3 免疫荧光鉴定
            3.5.4 体外分化能力的鉴定
            3.5.5 多能性基因的鉴定
    4 讨论
        4.1 超数排卵对兔囊胚贴壁和兔类 ES 细胞克隆的影响
        4.2 胚胎的不同处理方式对兔类 ES 细胞分离培养的影响
        4.3 兔囊胚在不同培养基上的生长、传代情况
        4.4 不同传代方法对兔类 ES 细胞分离传代的影响
        4.5 兔类 ES 细胞鉴定
    5 小结
第三章 兔类 ES 细胞向原始生殖细胞诱导的初步探讨
    1 引言
    2 材料与方法
        2.1 试验材料
            2.1.1 试验对象
            2.1.2 主要试剂与仪器
        2.2 主要试剂的配制
            2.2.1 视黄酸
            2.2.2 诱导基础液和诱导液
        2.3 试验方法
            2.3.1 类胚体的制作
            2.3.2 RA 体外诱导兔类 ES 细胞定向分化
            2.3.3 DNA 倍体分析
    3 结果与分析
        3.1 ES 细胞生长情况及鉴定
        3.2 ES 细胞定向诱导分化后的形态特征
        3.3 DNA 倍体分析结果
    4 讨论
    5 小结
第四章 结论
参考文献
中英文缩略语表
ABSTRACT
作者简介



本文编号：3873672