表达EGFP的重组产单核细胞李氏杆菌的构建及其免疫特性研究

发布时间：2024-01-25 10:46

　　产单核细胞李氏杆菌(Listeria monocytogenes, LM)为胞内寄生菌,可在宿主细胞浆中繁殖,因此,其减毒菌株可作为活疫苗载体,诱导机体产生抗原特异性的细胞免疫应答。PCR分别扩增绿色荧光蛋白EGFP基因、产单核细胞李氏杆菌hly基因启动子Phly和actA基因启动子Pact A,将表达盒Phly-egfp和PactA-egfp分别克隆至单增李斯特菌复制型质粒pKSV7,得重组质粒pKSV7-Phly-egfp和pKSV7-PactA-egfp;重组质粒分别电转化缺失actA/plcB的产单核细胞李氏杆菌LM-1003感受态细胞,经抗生素抗性筛选和PCR鉴定得候选菌株Lm-PactA-EGFP(LM-1007)、 Lm-Phly-EGFP(LM-1010);荧光显微镜观察证实候选菌株均表达EGFP,共聚焦显微镜观察证实候选菌株在被感染的小鼠巨噬细胞J774.A1中均表达EGFP,表明启动子Phly和PactA在体内和体外均工作。15只6-8周龄BABL/c(H-2Kd)小鼠平均分为3组,每组每只小鼠分别接种PBS、107CFU LM-1011(pKSV7-Phly电转化...

【文章页数】：71 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1 产单核细胞李氏杆菌的研究进展
        1.1 产单核细胞李氏杆菌概述
        1.2 产单核细胞李氏杆菌致病机理
    2 产单核细胞李氏杆菌作为活疫苗载体的研究概述
        2.1 LM活疫苗载体的基本原理
        2.2 LM活载体疫苗的构建
        2.3 减毒LM作为活疫苗载体的优势
    3 疫苗佐剂
        3.1 铝盐类胶体佐剂
        3.2 弗氏佐剂(Freund's adjuvant,FA)
        3.3 CpG
        3.4 ActA作为一种新型免疫佐剂
    4 本研究目的和意义
    参考文献
第二章 表达EGFP的重组产单核细胞李氏杆菌的构建及其免疫特性研究
    摘要
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
        1.2 引物设计与合成
        1.3 PCR扩增
        1.4 pUC19-Phly,pUC19-PactA,pUC19-egfp克隆载体的构建及鉴定
        1.5 pKSV7-Phly-egfp,pKSV7-PactA-egfp、pKSV7-Phly载体构建及鉴定
        1.6 pKSV7-Phly、pKSV7-Phly-egfp,pKSV7-PactA-egfp电转化至LM-1003
        1.7 细胞培养
        1.8 激光共聚焦显微镜下观察
        1.9 动物免疫实验
    2 结果
        2.1 pKSV7-PactA-egfp,pKSV7-Phly-egfp质粒载体的构建
        2.2 荧光显微镜下观察LM1007,LM1010
        2.3 在激光共聚焦显微镜观察
        2.4 动物实验
    3 讨论
    参考文献
    ABSTRACT
第三章 产单核细胞李氏杆菌的ActA蛋白NH₂结构域(30-264aa)具分子佐剂特性
    摘要
    1 材料和方法
        1.1 实验材料
        1.2 绿色荧光蛋白EGFP的大肠杆菌表达与纯化
        1.3 ActA(30-264aa)的大肠杆菌表达与纯化
        1.4 EGFP与ActA蛋白纯化后切胶回收
        1.5 动物免疫实验
    2 结果
        2.1 EGFP蛋白的表达与纯化
        2.2 ActA蛋白的表达与纯化
        2.4 动物实验
    3 讨论
    参考文献
    ABSTRACT
全文总结
致谢
附录1 实验材料与仪器
附录2 培养基和溶液配方



本文编号：3884677