水牛抑制素α亚基基因（INHA）RNAi载体干扰效果分析及其转基因小鼠模型的构建

发布时间：2024-02-24 18:58

　　水牛是我国南方非常重要的役用动物,肉用和乳用潜力很大,但是水牛繁殖性能和泌乳性能低下。抑制素(inhibin,INH)负反馈调控FSH的合成与分泌,降低水牛的繁殖性能；水牛妊娠期长而且实验成本高,因此,我们以小鼠为试验动物模型,开展水牛INH的RNAi的干扰效果的研究,为生产具有高繁殖性能的转基因水牛提供参考。在本研究中,我们以水牛INHA为靶基因构建RNAi载体,在小鼠卵巢颗粒细胞上进行干扰效果的分析,筛选出干扰效果较好的RNAi片段,随后应用显微注射技术将该片段整合到小鼠基因组中,以进一步在转基因RNA i小鼠中分析该片段的干扰效果,为高繁殖力转基因水牛的研究打下基础。本研究主要结果如下：(1)根据水牛INHA(EU884446.1) mRNA CDS设计四条s hRNA,分别命名为：shRNA-b1, shRNA-b2, shRNA-b3和shRNA-b4(阴性对照)。(2)利用PiggyBac转座子载体phi5,成功构建了四个RNAi干扰表达载体,分别命名为：phi5siRNA-b1, phi5siRNA-b2, phi5siRNA-b3 和 phi5siRNA-b4(阴性对照...

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【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
缩略词表(Abbreviation words)
1 文献综述
    1.1 抑制素的研究进展
        1.1.1 抑制素基因的结构和组织分布
        1.1.2 抑制素基因的功能
        1.1.3 抑制素基因在生产上的应用
    1.2 转基因RNAi小鼠的研究现状
        1.2.1 RNAi的作用机理和特性
        1.2.2 RNAi体外制备方法
        1.2.3 RNAi技术的用途及发展前景
        1.2.4 RNAi在转基因小鼠上的应用
    1.3 研究目的和意义
2 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 PiggyBac转座子载体
        2.1.2 实验小鼠和细胞
        2.1.3 主要试剂耗材
        2.1.4 相关溶液的配制
        2.1.5 主要仪器设备
    2.2 方法
        2.2.1 shRNA序列设计与合成
        2.2.2 phi5siRNA载体的构建与鉴定
        2.2.3 小鼠卵巢颗粒细胞的培养
        2.2.4 重组载体转染小鼠卵巢颗粒细胞的条件优化
        2.2.5 重组载体转染小鼠卵巢颗粒细胞
        2.2.6 重组载体对INHA基因抑制效率的测定
        2.2.7 重组载体的线性化酶切与显微注射
        2.2.8 转基因RNAi小鼠的PCR鉴定
3 结果与分析
    3.1 shRNA序列设计
    3.2 phi5siRNA载体的构建与鉴定
        3.2.1 phi5空载体的线性化双酶切
        3.2.2 重组载体的酶切鉴定
        3.2.3 重组载体的测序鉴定
    3.3 重组载体转染小鼠卵巢颗粒细胞条件的优化
    3.4 重组载体转染小鼠卵巢颗粒细胞
    3.5 重组载体干扰效率的测定
        3.5.1 RNA的质量检测
        3.5.2 定量引物RT-PCR扩增效果检测
        3.5.3 荧光定量PCR(qPCR)的检测结果
    3.6 用于转基因小鼠制作的载体的线性化酶切
    3.7 转基因RNAi小鼠的PCR鉴定
4 讨论
    4.1 关于phi5载体的使用
    4.2 关于phi5siRNA载体的构建方法
    4.3 关于小鼠卵巢颗粒细胞的培养
    4.4 关于靶序列的选择背景和干扰效果的讨论
    4.5 关于转基因阳性小鼠的鉴定
5 结论
6 创新点、不足和下一步研究计划
参考文献
附录
在校期间发表文章、专利
致谢



本文编号：3909472