奶牛乳腺上皮细胞的永生化及其鉴定

发布时间：2024-03-10 20:11

　　奶牛乳腺上皮细胞是唯一的乳腺分泌型细胞,其数量和活力决定了乳的产量和品质。体外培养的奶牛乳腺上皮细胞组成单一,脱离了在体复杂环境的干扰,是研究乳腺发育和泌乳机制、乳腺生物反应器的有效细胞模型。目前,还没有国际公认的永生化奶牛乳腺上皮细胞系,因此,建立稳定有效的奶牛乳腺上皮细胞系这项研究工作一直在延续。本研究中,奶牛乳腺上皮细胞的永生化及鉴定工作分为4部分： 1.原代奶牛乳腺上皮细胞的永生化。在以往的研究中,作者已建立一套原代奶牛乳腺上皮细胞体外培养体系。在本研究中,以此原代细胞培养体系为基础,采用携带SV40大T抗原基因的逆转录病毒感染原代奶牛乳腺上皮细胞,获得4株永生化的奶牛乳腺上皮细胞系。经过传代培养,最终得到一株传代超过50代的永生化奶牛乳腺上皮细胞系,命名为CMEC-H; 2.永生化细胞的生物学鉴定。对永生化的奶牛乳腺上皮细胞系CMEC-H进行端粒酶活性检测,20代的CMEC-H的端粒酶活性水平与293细胞水平一致,说明SV40大T抗原基因的插入使原代奶牛乳腺上皮细胞成功永生化；永生化的CMEC-H保持了原代细胞的形态特征,呈鹅卵石样；细胞增殖速率加快,细胞倍增时间约为36h,...

【文章页数】：82 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
第一章 奶牛乳腺上皮细胞体外培养及其应用研究进展
    1.1 奶牛乳腺上皮细胞是重要的乳腺分泌型细胞
        1.1.1 奶牛乳腺上皮细胞是重要的乳腺分泌细胞
        1.1.2 奶牛乳腺上皮细胞体外培养
    1.2 乳腺干细胞
    1.3 细胞永生化
        1.3.1 细胞永生化及端粒酶
        1.3.2 SV40-large T antigene
        1.3.3 逆转录病毒
    1.4 永生化奶牛乳腺上皮细胞系的应用及展望
        1.4.1 奶牛乳腺上皮细胞模型在乳蛋白合成机制研究领域的应用
        1.4.2 永生化奶牛乳腺上皮细胞模型应用展望
第二章 永生化奶牛乳腺上皮细胞系的建立
    2.1 材料和方法
        2.1.1. 主要试剂和耗材
    2.2. 方法
        2.2.1 质粒的转化
        2.2.2 原代细胞的培养
        2.2.3 逆转录病毒包装
        2.2.4 病毒感染效率的检测
        2.2.5 乳腺上皮细胞的感染
        2.2.6 单克隆细胞株的获得及持续培养
    2.3 结果
        2.3.1 质粒的转化
        2.3.2 原代细胞的准备
        2.3.3 逆转录病毒制备及病毒滴度检测
        2.3.4 乳腺上皮细胞的感染及单克隆细胞株的获得
        2.3.5 永生化细胞的传代和培养
    2.4 讨论
    2.5 结论
第三章 永生化奶牛乳腺上皮细胞系的生物学鉴定
    3.1 材料和方法
        3.1.1. 主要试剂和耗材
        3.1.2. 方法
    3.2 结果
        3.2.1 永生化细胞的生物学形态
        3.2.2 端粒酶表达在永生化细胞中的表达
        3.2.3 永生化细胞生长特性
        3.2.4 永生化细胞的核型分析
        3.2.5 永生化细胞裸鼠致瘤检测
    3.3 讨论
    3.4 小结
第四章 永生化奶牛乳腺上皮细胞系的特征性蛋白表达
    4.1 材料和方法
        4.1.1. 主要试剂和耗材
        4.1.2.方法
    4.2 结果
        4.2.1 上皮细胞特征性蛋白检测
        4.2.2 纤维细胞特征性蛋白检测
        4.2.3 干细胞特征性蛋白检测
    4.3 讨论
    4.4 小结
第五章 永生化奶牛乳腺上皮细胞系的诱导分化
    5.1 材料和方法
        5.1.1. 主要试剂和耗材
        5.1.2. 方法
        5.1.3. 数据分析
    5.2 结果
        5.2.1 乳蛋白基因及合成调控基因的表达
        5.2.2 乳蛋白合成检测
    5.3 讨论
    5.4 小结
第六章 全文结论
参考文献
致谢
个人简介



本文编号：3925254