狂犬病毒街毒株DRV-AH08基因组序列测定分析及G蛋白免疫原性研究
发布时间：2024-03-17 01:54
狂犬病是一种古老的而又持续流行至今的自然疫源性疾病。由于其发病后100%的致死率,狂犬病在全球范围内每年会夺走近5.5万人的生命。中国是发病例数仅次于印度的狂犬病肆虐区,正在经历新中国成立以来的第三次狂犬病大流行,年均约2000～3000患者因此而丧生。 作为一种负链RNA病毒,狂犬病毒遗传变异很快。国际病毒分类学委员会(ICTV)于2012年将全球的狂犬病毒属分为RABV、LBV、MOKV、DUVV、EBLV-1、 EBLV-2、ABLV、ARAV、KHUV、IRKV、WCBV和HIBV共12个基因型,我国目前主要流行的为RABV狂犬病毒。 G蛋白是狂犬病毒的主要毒力决定因素。研究发现狂犬病毒弱毒株与街毒株致病性不同的主要原因之一是G蛋白的表达水平不同。 鉴于此,本研究针对2008年分离自中国安徽犬脑的一株狂犬病毒街毒株DRV-AH08进行基因组序列测定及系统进化分析,进一步研究该毒株与弱毒株ERA株G蛋白表达量、免疫原性和重组疫苗对小鼠的免疫效果的差异。主要研究内容如下： 1狂犬病毒街毒株DRV-AH08的分类鉴定及全基因组序列测定 RT-nest PCR扩增结果表明,DRV-AH...
【文章页数】：150 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
第一章 文献综述
1.1 狂犬病概述
1.2 狂犬病流行概况
1.2.1 世界狂犬病流行概况
1.2.2 中国狂犬病流行概况
1.3 狂犬病毒的研究进展
1.3.1 狂犬病毒的分类
1.3.2 狂犬病毒的形态和构成
1.3.3 狂犬病毒的基因组结构及各编码蛋白的功能
1.4 狂犬病的防治措施
1.5 狂犬病疫苗研究现状
1.5.1 人用狂犬病疫苗
1.5.2 兽用狂犬病疫苗
1.5.3 发展中的狂犬病疫苗
第二章 研究的目的及意义
2.1 狂犬病毒街毒株DRV-AH08基因组序列测定分析的研究目的及意义
2.2 G蛋白免疫原性研究的目的及意义
第三章 材料与方法
3.1 材料
3.1.1 病毒、细胞和菌株
3.1.2 载体与质粒
3.1.3 引物、工具酶及主要试剂
3.1.4 免疫反应试验所用抗原及血清
3.1.5 培养基与抗生素及其配制
3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制
3.1.7 其它缓冲液及试剂
3.1.8 实验动物
3.2 试验方法
3.2.1 病毒增殖
3.2.2 鼠脑组织总RNA提取
3.2.3 狂犬病毒核酸RT-PCR检测
3.2.4 PCR产物或酶切产物的电泳检测
3.2.5 酶切产物回收与纯化
3.2.6 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
3.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备
3.2.8 连接产物的转化
3.2.9 质粒的制备与鉴定
3.2.10 序列分析方法
3.2.11 重组Bacmid DNA的提取
3.2.12 重组杆状病毒获得
3.2.13 重组杆状病毒转导SF9昆虫细胞/BHK细胞
3.2.14 蛋白浓度测定
3.2.15 SDS-PAGE电泳和Western Blot检测目的蛋白的体外表达
3.2.16 小鼠的免疫与攻毒保护性试验
3.2.17 小鼠半数致死量(mLD 50)测定
3.2.18 狂犬病毒CVS-11 TCID50测定
3.2.19 FAVN检测血清中中和抗体水平
3.2.20 试验丢弃物的无害化处理
3.2.21 统计学方法
第四章 实验结果
4.1 狂犬病毒街毒株DRV-AH08全基因组序列测定
4.1.1 狂犬病毒街毒株DRV-AH08核酸鉴定分析
4.1.2 狂犬病毒街毒株全基因组序列测定
4.2 狂犬病毒街毒株DRV-AH08全基因组序列分析
4.2.1 分析所用序列
4.2.2 DRV-AH08全基因组组成及分析
4.2.3 狂犬病毒野毒株DRV-AH08系统进化分析
4.2.4 clade Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ狂犬病毒进化分析
4.2.5 中国流行亚类China Ⅰ和墨西哥流行株DRV-Mexico比较分析
4.3 讨论
4.3.1 关于狂犬病毒属分类
4.3.2 关于DRV-AH08全基因组序列测定
4.3.3 关于DRV-AH08全基因组结构分析
4.3.4 关于DRV-AH08全基因组系统进化分析
4.4 小结
4.5 不同毒力毒株G蛋白免疫原性研究
4.5.1 转移质粒pFastBac-X的构建
4.5.2 穿梭质粒Bacmid-X的构建
4.5.3 重组杆状病毒BAC-X的制备
4.5.4 重组杆状病毒转导Sf9昆虫细胞
4.5.5 重组杆状病毒转导BHK细胞
4.5.6 各重组杆状病毒囊膜上G蛋白携带量研究
4.5.7 等量重组杆状病毒免疫小鼠实验
4.5.8 等量G蛋白免疫小鼠实验
4.5.9 重组杆状病毒免疫小鼠实验结果分析
4.5.10 讨论
4.5.11 小结
参考文献
致谢
附录
本文编号：3930337
【文章页数】：150 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
第一章 文献综述
1.1 狂犬病概述
1.2 狂犬病流行概况
1.2.1 世界狂犬病流行概况
1.2.2 中国狂犬病流行概况
1.3 狂犬病毒的研究进展
1.3.1 狂犬病毒的分类
1.3.2 狂犬病毒的形态和构成
1.3.3 狂犬病毒的基因组结构及各编码蛋白的功能
1.4 狂犬病的防治措施
1.5 狂犬病疫苗研究现状
1.5.1 人用狂犬病疫苗
1.5.2 兽用狂犬病疫苗
1.5.3 发展中的狂犬病疫苗
第二章 研究的目的及意义
2.1 狂犬病毒街毒株DRV-AH08基因组序列测定分析的研究目的及意义
2.2 G蛋白免疫原性研究的目的及意义
第三章 材料与方法
3.1 材料
3.1.1 病毒、细胞和菌株
3.1.2 载体与质粒
3.1.3 引物、工具酶及主要试剂
3.1.4 免疫反应试验所用抗原及血清
3.1.5 培养基与抗生素及其配制
3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制
3.1.7 其它缓冲液及试剂
3.1.8 实验动物
3.2 试验方法
3.2.1 病毒增殖
3.2.2 鼠脑组织总RNA提取
3.2.3 狂犬病毒核酸RT-PCR检测
3.2.4 PCR产物或酶切产物的电泳检测
3.2.5 酶切产物回收与纯化
3.2.6 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
3.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备
3.2.8 连接产物的转化
3.2.9 质粒的制备与鉴定
3.2.10 序列分析方法
3.2.11 重组Bacmid DNA的提取
3.2.12 重组杆状病毒获得
3.2.13 重组杆状病毒转导SF9昆虫细胞/BHK细胞
3.2.14 蛋白浓度测定
3.2.15 SDS-PAGE电泳和Western Blot检测目的蛋白的体外表达
3.2.16 小鼠的免疫与攻毒保护性试验
3.2.17 小鼠半数致死量(mLD 50)测定
3.2.18 狂犬病毒CVS-11 TCID50测定
3.2.19 FAVN检测血清中中和抗体水平
3.2.20 试验丢弃物的无害化处理
3.2.21 统计学方法
第四章 实验结果
4.1 狂犬病毒街毒株DRV-AH08全基因组序列测定
4.1.1 狂犬病毒街毒株DRV-AH08核酸鉴定分析
4.1.2 狂犬病毒街毒株全基因组序列测定
4.2 狂犬病毒街毒株DRV-AH08全基因组序列分析
4.2.1 分析所用序列
4.2.2 DRV-AH08全基因组组成及分析
4.2.3 狂犬病毒野毒株DRV-AH08系统进化分析
4.2.4 clade Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ狂犬病毒进化分析
4.2.5 中国流行亚类China Ⅰ和墨西哥流行株DRV-Mexico比较分析
4.3 讨论
4.3.1 关于狂犬病毒属分类
4.3.2 关于DRV-AH08全基因组序列测定
4.3.3 关于DRV-AH08全基因组结构分析
4.3.4 关于DRV-AH08全基因组系统进化分析
4.4 小结
4.5 不同毒力毒株G蛋白免疫原性研究
4.5.1 转移质粒pFastBac-X的构建
4.5.2 穿梭质粒Bacmid-X的构建
4.5.3 重组杆状病毒BAC-X的制备
4.5.4 重组杆状病毒转导Sf9昆虫细胞
4.5.5 重组杆状病毒转导BHK细胞
4.5.6 各重组杆状病毒囊膜上G蛋白携带量研究
4.5.7 等量重组杆状病毒免疫小鼠实验
4.5.8 等量G蛋白免疫小鼠实验
4.5.9 重组杆状病毒免疫小鼠实验结果分析
4.5.10 讨论
4.5.11 小结
参考文献
致谢
附录
本文编号：3930337
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