绵羊Zfy基因干扰载体筛选及性控效果的验证

发布时间：2024-04-15 04:30

　　Zfy (Zinc-finger Y)基因位于Y染色体的短臂上，是一段可编码锌指蛋白的高度保守基因序列。Zfy基因具有特定的核定位信号区域，能够特异性的引导靶基因穿过核膜，定位于精子细胞核内，可能对精子变态过程中的某些基因具有转录激活作用，与Y精子的结构和功能发挥有关。本研究根据Zfy基因特点，通过设计shRNA片段，对绵羊的Zfy基因进行细胞水平上的RNAi实验，通过qRT-PCR分析后，选取对Zfy基因mRNA表达水平抑制率最高的片段，通过睾丸注射法注射给雄性公羊，人工授精后，统计经干扰后后代的性别比例。具体研究结果如下： 1.绵羊Zfy基因cDNA序列克隆：以人和牛的Zfy基因序列为参考，分段设计3对引物，采用普通PCR技术扩增，测序，使用DNAMAN软件拼接及分析，首次克隆到长为2247bp的绵羊Zfy基因mRNA的拼接序列。 2.根据克隆到的绵羊Zfy基因mRNA序列，按照RNAi设计原则，针对该基因的编码区设计并合成5对shRNA干扰片段。以pll3.7慢病毒骨架质粒作为载体，构建了5个靶向Zfy基因的shRNA表达载体(A-E)。经过测序证实所构建的5个表达载体含有合成的...

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摘要
Abstract
论文中常用缩写词英汉对照表
前言
综述部分
    1. RNA 干扰的原理
        1.1 RNAi 的发展史
        1.2 RNAi 的作用机理
        1.3 RNAi 的常用载体
        1.4 RNAi 的设计原则
    2. 性别控制技术的研究进展
        2.1 Gadd45G 基因
        2.2 MAPK 细胞通路
        2.3 GATA4 基因
        2.4 Sry 基因
        2.5 Zfy 基因
        2.6 Sox 基因
    3. 总结和展望
    参考文献
试验研究
    实验一 绵羊 Zfy 基因 mRNA 序列的克隆
        1. 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2. 结果与分析
            2.1 睾丸组织总 RNA 的提取
            2.2 PCR 扩增结果
            2.3 菌液 PCR 鉴定
            2.4 测序结果
        3. 讨论
        参考文献
    实验二 绵羊 Zfy 基因 shRNA 表达载体的构建
        1. 材料与方法
            1.1 主要试剂
            1.2 主要仪器
            1.3 方法
        2. 结果与分析
            2.1 siRNA 序列的选择
            2.2 表达载体的克隆与酶切鉴定
        3. 讨论
            3.1 siRNA 的表达方法
            3.2 表达载体的选择
            3.3 重组质粒的鉴定
        参考文献
    实验三 绵羊 Zfy 基因体外干扰实验
        1. 材料
            1.1 主要试剂
            1.2 主要仪器
            1.3 主要 PCR 引物
            1.4 主要实验动物
        2. 主要实验方法
            2.1 重组表达质粒的制备
            2.2 生精细胞的分离与培养
            2.3 重组表达质粒转染生精细胞
            2.4 测定生精细胞 Zfy 基因 mRNA 表达水平
        3. 结果与分析
            3.1 重组表达载体转染生精细胞
            3.2 PCR 结果分析
            3.3 Zfy 基因 mRNA 表达水平
        4.讨论
        参考文献
    实验四 Zfy 基因 shRNA 表达载体的体内 RNA 干扰试验
        1.材料与方法
            1.1 主要试剂
            1.2 主要仪器
            1.3 主要实验动物
            1.4 重组表达质粒的大量制备与纯化
            1.5 绵羊体内 Zfy 基因 RNAi 实验
        2.结果与分析
            2.1 后代性别比例
            2.2 Zfx 基因 mRNA 表达水平
        3.讨论
        参考文献
结论
创新点
致谢
作者简介



本文编号：3955737