核定位信号对病毒衣壳蛋白在E.coli中表达的影响及重组衣壳蛋白免疫学活性研究

发布时间：2024-04-26 00:28

　　本文以猪圆环病毒3型的衣壳蛋白(PCV3-CP)及其核定位信号(NLS)为研究对象,通过对PCV3-CP的NLS序列进行分析和改构,成功实现了重组PCV3-CP在大肠杆菌表达系统中的可溶性高表达。我们还利用了小鼠模型和斑马鱼模型对重组PCV3-CP及佐剂的免疫学活性进行评价,结果发现重组PCV3-CP可以成功诱导小鼠产生特异性抗体,并能够刺激B细胞的活化,还发现了不同的ODN佐剂对于斑马鱼中性粒细胞的募集有着不同作用。本研究为重组蛋白在大肠杆菌表达系统中实现可溶性高表达提供了新的改构思路,并初步验证了通过斑马鱼模型评价疫苗及佐剂的可行性。

【文章页数】：94 页

【学位级别】：硕士

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摘要
中文摘要
Abstract
中英文缩写词表
第一篇 绪论
    1.核定位信号的结构与功能
        1.1 核定位信号的序列及结构特点
        1.2 核定位信号的作用机制及应用
    2.病毒衣壳蛋白疫苗的研究现状
    3.猪圆环病毒的研究现状
        3.1 PCV1 研究现状
        3.2 PCV2 研究现状
        3.3 PCV3 研究现状
    4.小鼠和斑马鱼作为免疫学评价模型的应用
    5.中性粒细胞提呈抗原的研究进展
第二篇 研究内容
    第一章 核定位信号对病毒衣壳蛋白在E.coli中表达的影响
        1.前言
        2.材料与方法
            2.1 实验材料
                2.1.1 试剂与材料
                2.1.2 菌种与质粒
                2.1.3 培养基配制
                2.1.4 主要仪器设备
            2.2 引物设计与合成
            2.3 实验方法
                2.3.1 PCR获取目的基因
                2.3.2 感受态细胞制备及转化
                2.3.3 TA连接及表达载体的构建
                2.3.4 蛋白的诱导表达鉴定与可溶性鉴定
                2.3.5 工程菌发酵与蛋白质纯化
                2.3.6 Western Blotting
                2.3.7 统计学分析
        3.实验结果
            3.1 PCV3 衣壳蛋白的序列比对、表位预测及改构设计
                3.1.1 PCV3 衣壳蛋白的序列比对与表位预测
                3.1.2 优势表位增强的重组蛋白的氨基酸序列设计
            3.2 重组PCV3 衣壳蛋白的构建与表达
                3.2.1 重组PCV3 衣壳蛋白基因的获取与TA克隆
                3.2.2 重组表达载体的构建
                3.2.3 Z蛋白的诱导表达
            3.3 密码子优化的重组PCV3 衣壳蛋白的构建与表达
                3.3.1 密码子优化序列的设计
                3.3.2 密码子优化的Z蛋白的诱导表达鉴定
            3.4 修改核定位信号序列后的重组PCV3 衣壳蛋白的构建与表达
                3.4.1 核定位信号序列的分析
                3.4.2 核定位信号序列的修改
                3.4.3 修改核定位信号的重组蛋白的诱导表达鉴定
                3.4.4 诱导条件的优化
                3.4.5 工程菌发酵与蛋白质纯化
                3.4.6 重组PCV3-CP在 SDS-PAGE中条带异常现象的探究
        4.讨论
            4.1 重组PCV3 衣壳蛋白的设计
            4.2 核定位信号序列对蛋白表达的影响
            4.3 提高蛋白表达量和可溶性的策略
            4.4 SDS-PAGE条带异常现象的探究
        5.本章小结
    第二章 重组PCV3 疫苗免疫学活性的研究
        1.前言
        2.材料与方法
            2.1 实验材料
                2.1.1 试剂与材料
                2.1.2 实验动物
                2.1.3 主要仪器设备
            2.2 实验方法
                2.2.1 疫苗的配制
                2.2.2 小鼠的免疫与采血
                2.2.3 ELISA检测血清特异性抗体水平
                2.2.4 脾细胞的分离与培养
                2.2.5 流式细胞术
                2.2.6 斑马鱼的注射
                2.2.7 斑马鱼的荧光观测
                2.2.8 统计学分析
        3.实验结果
            3.1 应用小鼠模型评价Zr蛋白的免疫学活性
                3.1.1 Zr蛋白诱导小鼠产生特异性抗体的研究
                3.1.2 Zr蛋白对小鼠B细胞活化作用的研究
            3.2 斑马鱼作为免疫应答模型的初探
                3.2.1 单独注射ODN或 PBS后斑马鱼中性粒细胞的募集情况
                3.2.2 注射Zr+CpG684 后斑马鱼中性粒细胞的募集情况
        4.讨论
            4.1 重组PCV3 疫苗在小鼠模型中的免疫学活性
            4.2 斑马鱼作为疫苗评价模型的初步应用
        5.本章小结
    第三章 结论
参考文献
致谢



本文编号：3964450