猪痘病毒TK、ORF121、ORF143基因缺失毒株的构建及其生物学特性的测定

发布时间：2024-04-28 05:51

　　为筛选猪痘病毒(SWPV)复制非必需区并测定其缺失株的生物学特性,本研究根据同源重组原理分别针对SWPV的TK(ORF063)、ORF121和ORF143基因设计引物。应用重叠延伸PCR技术拼接同源重组左右臂及EGFP筛选标记表达盒,将拼接片段分别转染到感染SWPV的PK15细胞。利用荧光显微镜观察标记含EGFP的单个蚀斑,筛选获取重组毒株。应用PCR及Western blotting对重组毒株进行鉴定。分别测定各毒株感染PK15细胞的蚀斑大小和皮下接种保育猪致病性。PCR结果表明,目的基因成功整合到相应位点,成功获得重组毒株rSWPV-TK、rSWPV-121和rSWPV-143;Western blotting结果显示,连续传代的重组毒株在PK15细胞上稳定表达外源蛋白。重组毒株在PK15细胞上形成的痘斑均小于亲本毒株,其中ORF121缺失株差异极显著(P<0.01)。各毒株均可导致保育猪痘斑形成,其中ORF121缺失株引起病变时间短,产生痘斑小,毒力较亲本下降。综上所述,本研究筛选到2个SWPV基因组中可供外源蛋白插入的复制非必需区ORF121和ORF143,为构建SWPV...

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【部分图文】：

图4转染结果(100×)

图3SOE-PCR扩增结果图5重组病毒纯化(100×)

图5重组病毒纯化(100×)

图4转染结果(100×)2.4重组病毒的PCR鉴定结果

图1rSWPV的构建示意图

用胰蛋白酶-EDTA消化,每48h传代PK15细胞,铺于6孔板中,生长至90%融合度时,取SWPV-JX20G株病毒液以含10%胎牛血清的DMEM培养基做5倍稀释后感染6孔板中细胞。吸附4h,期间每隔30min轻晃摇匀,使病毒充分感染PK15细胞。以总量4μg目的基因转染....

图2片段扩增结果

以SWPV-JX20G株基因组为模板扩增同源重组左右臂片段,片段大小分别为ORF121左臂786bp、ORF121右臂843bp、ORF143左臂883bp、ORF143右臂835bp、TK左臂947bp、TK右臂1022bp,pSWE11-28C为模板扩增缺失回补....

本文编号：3966259