鸡朊蛋白参与DF-1细胞增殖粘附的功能研究

发布时间：2024-05-11 03:34

　　【目的】本研究通过克隆禽源U6（cU6）和人源U6（hU6）启动子，构建以绿色荧光蛋白EGFP作为报告基因的真核表达载体，分别比较二者在Hela细胞和DF-1细胞中的转录活性，进一步分析cU6启动子在禽源细胞体外表达系统中的应用潜力；应用cU6启动子构建真核表达载体，建立鸡朊蛋白（ChPrPC）过表达的DF-1稳定细胞系，为进一步探讨ChPrPC影响禽类细胞分化、增殖及凋亡的分子机制提供稳定的细胞模型；参考PrPC的促细胞增殖及粘附的功能，通过分析ChPrPC过表达对DF-1细胞增殖、粘附和侵袭的影响，为进一步阐明ChPrPC生理功能提供依据。 【方法】参考已报道的U6启动子序列设计特异性引物，通过PCR扩增和克隆获得cU6和hU6核心启动子序列，构建以绿色荧光蛋白作为报告基因的禽源和人源U6启动子重组表达载体，分别转染Hela和DF-1细胞系，应用倒置荧光显微镜、荧光定量RT-PCR、Western blot、流式细胞术等方法，分别检测不同的重组载体转染Hela和DF-1细胞12、24和36h后荧光阳性细胞数和EGFP表达水平差异；根据本实验室已克隆的鸡朊蛋白基因全长序列设计引物，通...

【文章页数】：78 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

图1-1核心启动子元件示意图

生物体所具有的遗传性状称之为表型，表型是基因型与外界环境因素相互作用的。传统研究认为，除环境因素影响外，生物体表型多态性主要是由于相关基因编码区造成的。近年研究发现，两个相近物种的蛋白质组成基本相同，却表现出明显的生理异[1]。因此，越来越多学者认为，物种间的差异不仅是基因水平上....

图1-2Caudal蛋白激活DPE元件或TATA框元件介导的转录Fig.1-2CaudalactivatestranscriptionfromDPE-dependentorTATA-dependentcorepromoters.

件（Motiftenelement，MTE）是过表达基因启动子序列的功能性激活位于DPE元件上游，处于Inr下游+18至+27位点，该序列元件在NA中高度保守[27]。DNaseⅠ足迹法证实，MTE元件同DPE元件相FⅡD特异性识别的序列元件[28]。MT....

图2-1人朊蛋白一级结构示意图

（Cys）残基之间有一个二硫键，能够稳定朊蛋白的高级构象（图2-1）[13]。序列分析显示，禽类PrP同哺乳动物朊蛋白基因推导氨基酸序列序列相比，同源性仅有30%。然而比较其高级结构发现，二者C-端均由2个短的反向平行β折叠和3个α螺旋组成球型结构域,且组成的二级结构元件长度及....

图2-2朊蛋白通过GPI锚定于细胞表面的高级结构示意图

同源性仅有30%。然而比较其高级结构发现，二者C-端均由2个短的反向平行β折叠和3个α螺旋组成球型结构域,且组成的二级结构元件长度及位置基本相同，并通过GPI受体结合位点附着于细胞膜上（图2-2）[14]。哺乳动物朊蛋白N-端的氨基酸残基之间有一个富含组氨酸和甘氨酸的八肽重复....

本文编号：3969462