脑心肌炎病毒双抗原夹心ELISA建立、血清学调查、毒株分离及RNA干扰研究

发布时间：2024-05-20 03:20

　　脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus, EMCV)可以感染多种哺乳动物、啮齿类动物、节肢动物和人并引发脑炎、心肌炎和心肌周围炎等症状；能引致母猪繁殖障碍和仔猪致死性心肌炎，致死率可达100%；而人多以亚临床形式存在。目前EMCV流行范围越来越广，在亚洲、非洲、美洲、欧洲和澳洲均有发现，且感染率逐年增加，不仅给养殖业造成严重的影响，同时也危害着人类健康。 本研究以脑心肌炎病毒为对象，进行了以下实验研究： 1.研发了EMCV双抗原夹心ELISA试剂盒并获得了国家发明专利授权：试剂盒以EMCV重组VP1、VP2和2C蛋白作为包被抗原，HRP标记的EMCV为酶标抗原，最适包被浓度为6μg/mL，最适酶标抗原浓度为1:400，最佳样品作用时间为45min，最佳显色时间为30min。与间接ELISA比较，符合率93.5%，特异性为95%，敏感性为92.9%，与FMD、HEV、PPV、BVDV等病毒抗血清无交叉反应，连续生产3批次，批间和批内CV%均小于6%。因此所研发的试剂盒重复性、特异性和稳定性较好，灵敏度较高，可以作为EMCV临床抗体检测和血清学调查有效的方法。 ...

【文章页数】：91 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 EMCV 分类
    1.2 EMCV 理化特征
    1.3 EMCV 分子生物学特征
    1.4 EMCV 致病性及临床症状
        1.4.1 EMCV 致病性
        1.4.2 EMCV 感染的临床症状
    1.5 EMCV 流行情况
    1.6 EMCV 毒株分离及鉴定
    1.7 EMCV 诊断和检测方法
    1.8 EMCV 的预防
    1.9 本研究意义
第二章 脑心肌炎病毒双抗原夹心 ELISA 建立
    2.1 材料和仪器设备
        2.1.1 主要试剂和材料
        2.1.2 主要仪器设备
        2.1.3 EMCV VP2 引物
    2.2 方法和步骤
        2.2.1 EMCV VP2 重组蛋白表达和纯化
        2.2.2 各组分最适浓度优化
        2.2.3 最佳反应时间优化
        2.2.4 组装试剂盒，确定说明书
        2.2.5 试剂盒质量检测
        2.2.6 与间接法 ELISA 比较
    2.3 结果与分析
        2.3.1 VP2 基因的 PCR 扩增
        2.3.2 PCR 产物和载体双酶切
        2.3.3 重组表达载体的构建
        2.3.4 重组蛋白的诱导表达
        2.3.5 Western-blot 分析
        2.3.6 最适包被浓度确定
        2.3.7 最适封闭液浓度确定
        2.3.8 最适酶标抗原浓度确定
        2.3.9 样品最佳反应时间优化
        2.3.10 酶标抗原最佳作用时间优化
        2.3.11 最佳显色时间优化
        2.3.12 试剂盒说明书
        2.3.13 试剂盒稳定性
        2.3.14 试剂盒特异性
        2.3.15 试剂盒精密性
        2.3.16 与间接法 ELISA 法比较
    2.4 小结
第三章 脑心肌炎病毒血清学调查
    3.1 材料和仪器设备
        3.1.1 血清样本
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器设备
    3.2 方法和步骤
        3.2.1 样品处理
        3.2.2 样品检测
    3.3 结果与分析
        3.3.1 全国各地区人感染 EMCV 血清学调查
        3.3.2 特定人群 EMCV 流行病学调查
        3.3.3 全国各地区猪感染 EMCV 流行病学调查
        3.3.4 固定猪群动态监测
    3.4 小结
第四章 脑心肌炎病毒甘肃毒株 GS01 分离鉴定
    4.1 材料和仪器设备
        4.1.1 材料
        4.1.2 细胞、菌株和质粒
        4.1.3 主要试剂
        4.1.4 主要仪器设备
        4.1.5 引物
    4.2 方法和步骤
        4.2.1 病料处理
        4.2.2 细胞接种
        4.2.3 RT-PCR 检测
        4.2.4 分离病毒鉴定
        4.2.5 基因序列测定和分析
    4.3 结果与分析
        4.3.1 病毒的分离培养
        4.3.2 PCR 检测结果
        4.3.3 测序结果及分析
        4.3.4 病毒 TCID50测定
        4.3.5 琼脂扩散结果
        4.3.6 荧光定量 PCR 结果
        4.3.7 病毒对小鼠致病性结果
        4.3.8 基因全序测定及分析
        4.3.9 Genbank 提交
    4.4 小结
第五章 RNAI 靶向 VP1 基因抑制脑心肌炎病毒复制
    5.1 材料和仪器设备
        5.1.1 细胞及毒株
        5.1.2 主要试剂
        5.1.3 主要仪器设备
        5.1.4 引物
    5.2 方法和步骤
        5.2.1 siRNA 序列的设计、合成和构建重组表达质粒
        5.2.2 重组质粒转染 BHK-21 细胞
        5.2.3 RNAi 抑制 EMCV 病毒复制
        5.2.4 病毒感染力测定（TCID50）
        5.2.5 荧光定量检测病毒基因复制情况
        5.2.6 shRNA 特异性验证
        5.2.7 shRNA 对真核表达载体 pEGFP-VP1 表达抑制情况
    5.3 结果与分析
        5.3.1 shRNA 重组质粒转染 BHK-21 细胞情况
        5.3.2 RNAi 抑制病毒复制效果观察
        5.3.3 病毒感染力测定（TCID50）测定结果
        5.3.4 荧光定量检测分析
        5.3.5 X109-2 组对乙型脑炎病毒、口蹄疫病毒复制作用
        5.3.6 对 X109-2 和 pEGFP–C1-VP1 质粒共转 CHO-K1
    5.4 小结
第六章 全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简历



本文编号：3978880