具有H1N1/2009病毒相同基因组合方式的流感病毒在猪体传代的毒力增强机制

发布时间：2024-05-21 18:41

　　2009年4月,一种新型的A型流感病毒在墨西哥和美国爆发,随后这种新出现的流感病毒快速的造成了21世纪第一次人类流感大流行。遗传学和系统发育进化分析显示H1N1/2009病毒是由猪群中多种谱系猪流感病毒病毒重排产生的。然而,系统发育进化分析还显示H1N1/2009分离株相对于其祖先猪流感病毒还具有一个较长的进化臂。因此,H1N1/2009病毒被认为是由一个重排的前体病毒从猪群中进化而来,但是由于缺少直接的流行病学监测证据,具有与H1N1/2009病毒相同重排模式的病毒从未被发现过。因而,H1N1/2009病毒的产生一直是一个悬而未决的科学问题。 为了模拟H1N1/2009病毒的产生途径,本研究将一株之前本实验室构建的与H1N1/2009病毒的基因组合方式一致的重排病毒(rH1N1)在猪体内连续传代,然后通过深度测序和基因组测序分析rH1N1传代病毒的遗传变异特征,并以猪、豚鼠、雪貂等动物模型研究了rH1N1传代病毒的致病性和传播性。研究发现,传至第九代时,传代病毒感染的猪出现明显的临床症状,包括发热、气喘、咳嗽等。从第九代猪体内采集了病毒样本,并对其遗传变异进行了系统的分析。深度测序结...

【文章页数】：136 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
目录
插图目录
附表目录
符号与縮略语
主要仪器设备
第一章 文献综述
    1.1 A型流感病毒的进化
        1.1.1 A型流感病毒的生态学
        1.1.2 A型流感病毒的宿主限制
        1.1.3 A型流感病毒的跨宿主传播的进化方式
        1.1.4 大流行流感病毒的重排模式
    1.2 猪是流感病毒的混合器
        1.2.1 猪在流感病毒传播中的作用
        1.2.2 猪对人流感和禽流感病毒易感
        1.2.3 猪、人、禽流感病毒在猪体内的重排
        1.2.4 猪传播流感病毒至人类
    1.3 H1N1/2009大流行流感病毒的产生和流行
        1.3.1 H1N1/2009病毒的流行情况
        1.3.2 H1N1/2009病毒的发病机制
        1.3.3 H1N1/2009病毒的起源
        1.3.4 H1N1/2009病毒的特性
        1.3.5 H1N1/2009病毒的流行动向
    1.4 H1N1/2009病毒分子研究进展
        1.4.1 表面蛋白
        1.4.2 聚合酶蛋白
        1.4.3 非结构蛋白和基质蛋白
    1.5 本研究的目的和意义
第二章 H1N1/2009“前体”病毒在猪体中传代
    摘要
    2.1 材料
        2.1.1 病毒
        2.1.2 购买材料及试剂
        2.1.3 配制试剂
        2.1.4 试验动物
        2.1.5 细胞
    2.2 方法
        2.2.1 病毒的猪体传代试验
        2.2.2 病毒样本半数组织感染量(TCID₅₀)的测定
        2.2.3 病理切片制作
        2.2.4 肺总体和微观病变打分
        2.2.5 数据统计分析
    2.3 结果
        2.3.1 传代病毒感染的猪临床症状观察
        2.3.2 传代病毒感染的猪肺组织病理学变化
        2.3.3 传代病毒感染的猪体内病毒的复制
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 第九代病毒样本的遗传变异分析及代表性克隆株的筛选
    摘要
    3.1 材料
        3.1.1 病毒
        3.1.2 购买材料及试剂
        3.1.3 配制试剂
        3.1.4 细胞
    3.2 方法
        3.2.1 病毒RNA提取
        3.2.2 病毒基因组分段RT-PCR扩增
        3.2.3 深度测序
        3.2.4 噬斑纯化
        3.2.5 病毒单克隆基因组测序(Sanger测序)
    3.3 结果
        3.3.1 第九代猪鼻洗液和BALF中病毒RNA基因组扩增
        3.3.2 第九代病毒准种深度测序分析
        3.3.3 上、下呼吸道中代表性病毒克隆株的筛选
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 第九代病毒克隆株的体外活性测定
    摘要
    4.1 材料
        4.1.1 病毒
        4.1.2 购买材料及试剂
        4.1.3 仪器
        4.1.4 配制试剂
        4.1.5 细胞
    4.2 方法
        4.2.1 体外生长曲线测定
        4.2.2 Western blot检测NP蛋白表达
        4.2.3 聚合酶活性测定
        4.2.4 剂量依赖性ELISA法测定病毒受体结合性
        4.2.5 NA酶活性测定
        4.2.6 数据统计分析
    4.3 结果
        4.3.1 第九代病毒克隆株体外复制力测定
        4.3.2 第九代病毒克隆株聚合酶活性测定
        4.3.3 第九代病毒克隆株受体结合性测定
        4.3.4 第九代病毒克隆株NA酶活性测定
    4.4 讨论
    4.5 小结
第五章 第九代病毒克隆株对猪的致病性及其接触传播性
    摘要
    5.1 材料
        5.1.1 病毒
        5.1.2 购买材料及试剂
        5.1.3 配制试剂
        5.1.4 试验动物
        5.1.5 细胞
    5.2 方法
        5.2.1 试验设计
        5.2.2 样本病毒半数组织感染量(TCID₅₀)的测定
        5.2.3 病理切片制作
        5.2.4 肺总体和微观病变打分
        5.2.5 数据统计分析
    5.3 结果
        5.3.1 攻毒猪和接触猪临床症状观察
        5.3.2 攻毒猪和接触猪肺病理变化和病毒载量测定
        5.3.3 攻毒猪和接触猪鼻拭子分毒情况
    5.4 讨论
    5.5 小结
第六章 第九代病毒克隆株在豚鼠间的接触传播性及关键氨基酸突变位点的鉴定
    摘要
    6.1 材料
        6.1.1 病毒
        6.1.2 购买材料及试剂
        6.1.3 配制试剂
        6.1.4 转录/表达载体
        6.1.5 试验动物
        6.1.6 细胞
    6.2 方法
        6.2.1 豚鼠接触传播试验
        6.2.2 病毒样本半数组织感染量(TCID₅₀)的测定
        6.2.3 突变病毒反向遗传操作系统质粒的构建
        6.2.4 突变病毒的拯救
        6.2.6 数据统计分析
    6.3 结果
        6.3.1 第九代病毒克隆在豚鼠间的接触传播
        6.3.2 突变病毒的拯救
        6.3.3 突变病毒感染豚鼠的鼻拭子排毒检测
    6.4 讨论
    6.5 小结
第七章 第九代病毒克隆株对雪貂的致病性及其呼吸道飞沫传播性
    摘要
    7.1 材料
        7.1.1 病毒
        7.1.2 购买材料及试剂
        7.1.3 配制试剂
        7.1.4 试验动物
        7.1.5 细胞
    7.2 方法
        7.2.1 雪貂试验设计
        7.2.2 病毒样本半数组织感染量(TCID₅₀)的测定
        7.2.3 病理切片制作
        7.2.4 肺总体和微观组织病理学评价
        7.2.5 数据统计分析
    7.3 结果
        7.3.1 攻毒组和呼吸道飞沫传播组雪貂的临床症状观察
        7.3.2 攻毒组和呼吸道飞沫传播组雪貂的肺病理变化
        7.3.3 攻毒组和呼吸道飞沫传播组雪貂鼻拭子的分毒情况
    7.4 讨论
    7.5 小结
结论
创新点
参考文献
致谢
作者简介



本文编号：3979769