融合域点突变的埃博拉GP蛋白重组新城疫病毒的构建与免疫评价

发布时间：2024-06-01 17:27

　　埃博拉出血热(Ebola haemorrhagic fever,EHF)是埃博拉病毒(Ebola Virus,EBOV)感染人体后导致发热和急性出血等症状的一种人兽共患烈性传染病。该病于1976年首次被报道,以2014年在西非爆发的EHF疫情最为严重,此次疫情导致超过28000人感染,11000人死亡,其危害性对人类公共卫生安全构成了严重威胁。我国虽未爆发该病,但仍需要研制出安全有效的疫苗来预防EHF。目前已报道埃博拉病毒具有6个亚型,扎伊尔型和苏丹型是造成人类感染的最主要病因,本迪布焦型和科特迪瓦型在人类中呈偶发感染,莱斯顿型和邦巴利型对人类没有致病性。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是副粘病毒科(Paramyxoviridae)的单股负链RNA病毒,其基因组编码6种结构蛋白(NP、M、P、F、L、HN)和2种非结构蛋白(W、V)。NDV作为活病毒疫苗载体具有较高的安全性和遗传稳定性,可以同时诱发动物机体多种免疫反应,因此被广泛应用于针对各种人类疾病的重组疫苗的研制。我们之前的研究表明,以NDV为载体构建表达EBOV GP的重组病毒rLa-EBOV...

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摘要
abstract
主要符号对照表
第一章 绪论
    1.1 埃博拉出血热及其疫苗现状
        1.1.1 埃博拉出血热流行特点及流行现状
        1.1.2 埃博拉出血热的发病机理及特征
        1.1.3 埃博拉病毒引发组织损伤的机制
        1.1.4 埃博拉出血热诊治与防控措施
        1.1.5 埃博拉出血热疫苗的研究现状
    1.2 埃博拉病毒的分子生物学特征
        1.2.1 EBOV的形态特征及基因组结构
        1.2.2 EBOV的基因组结构及蛋白功能
        1.2.3 GP蛋白的结构和功能
    1.3 新城疫病毒
        1.3.1 新城疫病毒粒子结构及基因组组成
        1.3.2 新城疫病毒载体系统的构成
        1.3.3 NDV作为疫苗载体的特点
        1.3.4 NDV作为疫苗载体的应用
        1.3.5 NDV作为疫苗载体的发展前景
    1.4 研究目的及意义
第二章 实验材料与实验方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 病毒株和细胞
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 血清、鸡胚和实验动物
    2.2 实验方法
        2.2.1 裂解位点突变型ZEBOV GP(I532R)克隆质粒的构建
        2.2.2 携带ZEBOV GP(I532R)的NDV全长重组基因组c DNA的构建
        2.2.3 重组病毒r La-EBOVGP(I532R)的拯救
        2.2.4 重组病毒r La-EBOVGP(I532R)的RT-PCR鉴定
        2.2.5 EBOVGP(I532R)的表达鉴定
            2.2.5.1 Western blot检测
            2.2.5.2 间接免疫荧光鉴定
        2.2.6 免疫电镜观察重组病毒粒子的形态特征
        2.2.7 重组病毒的体外感染试验
        2.2.8 重组病毒的致病性分析
        2.2.9 重组病毒的生长动力学特征分析
            2.2.9.1 鸡胚半数感染量(EID50)的测定
            2.2.9.2 组织细胞半数感染量(TCID50)的测定
        2.2.10 重组病毒对小鼠的安全性试验
        2.2.11 小鼠的免疫试验
            2.2.11.1 ELISA检测特异性抗体水平
            2.2.11.2 中和抗体的免疫效力检测
第三章 实验结果
    3.1 裂解位点突变型ZEBOV GP(I532R)基因序列的鉴定及分析
    3.2 携带ZEBOV GP(I532R)的NDV全长重组基因组c DNA的构建及病毒拯救
    3.3 重组病毒的RT-PCR鉴定
    3.4 ZEBOV GP(I532R)的表达鉴定
        3.4.1 Western blot检测
        3.4.2 IFA检测ZEBOV GP(I532R)在细胞中的表达
    3.5 免疫电镜观察重组病毒粒子的形态特征
    3.6 r La-EBOVGP(I532R)在体外的感染性分析
    3.7 r La-EBOVGP(I532R)的致病性分析
    3.8 重组病毒生长动力学特征分析
        3.8.1 r La-EBOVGP(I532R)的鸡胚生长动力学特征分析
        3.8.2 r La-EBOVGP(I532R)的体外生长动力学特征分析
    3.9 r La-EBOVGP(I532R)在小鼠中安全性试验
    3.10 小鼠的免疫试验
        3.10.1 小鼠血清中特异性IgG水平及亚型的测定
        3.10.2 小鼠的中和抗体水平分析
第四章 讨论
第五章 全文结论
参考文献
附录 A
附录 B
致谢
作者简历



本文编号：3986229