猪圆环病毒PCV3型Cap蛋白和EGFP融合表达的研究

发布时间：2024-06-01 19:06

　　猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)是2016年首次于美国发现的一种新型猪圆环病毒。该病毒对处于各个年龄段的猪群均有较强的侵染性,特别是仔猪和处于妊娠期的母猪感染的几率更高。PCV3引起猪皮炎与肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、仔猪先天性震颤(congenital tremors,CT)、母猪繁殖障碍和多系统的炎症反应等疾病,已经在世界多个国家和地区存在和流行。因此,对PCV3的检测和防治相当重要。本文根据PCV3Cap蛋白序列和大肠杆菌密码子的偏爱性,对PCV3中Cap蛋白基因序列进行优化改造并合成。把合成的Cap蛋白基因片段和EGFP荧光蛋白基因片段相连接,作为目的基因插入pET28a载体质粒的NcoⅠ和HindⅢ酶切位点之间,构建成pET28a-PCV3-Cap-EGFP重组质粒。经测序和PCR扩增鉴定正确后,转化入BL21(DE3)中,并对其进行IPTG浓度、诱导时间和温度等诱导条件的优化。通过SDS-PAGE凝胶电泳和菌液的激光扫描共聚焦显微镜结果分析可知,...

【文章页数】：51 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
1 前言
    1.1 猪圆环病毒的研究进展
        1.1.1 猪圆环病毒的研究背景
        1.1.2 猪圆环病毒的理化性质
        1.1.3 猪圆环病毒的分子生物学特性
    1.2 猪圆环病毒的相关疾病与致病性研究
    1.3 猪圆环病毒的流行病学研究现状
        1.3.1 猪圆环病毒在国外的流行情况
        1.3.2 猪圆环病毒在国内的流行情况
    1.4 PCV3的检测方法
        1.4.1 聚合酶链式反应(PCR)
        1.4.2 多重PCR法
        1.4.3 巢式PCR法
        1.4.4 荧光定量PCR法
        1.4.5 多重实时定量聚合酶链反应法(mqPCR)
        1.4.6 实时重组酶聚合酶扩增测试法(rt-RPA)
        1.4.7 环介导等温扩增技术(LAMP)
        1.4.8 酶联免疫吸附反应(ELISA)
        1.4.9 免疫组织化学技术(HC)
    1.5 研究的目的和意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 质粒与菌株
        2.1.2 实验所用主要试剂
        2.1.3 主要仪器设备
        2.1.4 实验所用培养基
        2.1.5 实验主要溶液的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 pET28a-PCV3-Cap-EGFP重组质粒的构建
            2.2.1.1 PCV3-Cap-EGFP基因的优化与合成
            2.2.1.2 实验所用引物的设计与合成
            2.2.1.3 重组质粒的合成
        2.2.2 重组质粒质粒的提取与鉴定
            2.2.2.1 重组质粒的提取
            2.2.2.2 重组质粒的鉴定
        2.2.3 重组质粒诱导条件的优化
            2.2.3.1 IPTG浓度对蛋白表达的影响
            2.2.3.2 诱导时间对蛋白表达的影响
            2.2.3.3 诱导温度对蛋白表达的影响
            2.2.3.4 SDS-PAGE凝胶电泳
        2.2.4 重组质粒菌液激光扫描共聚焦显微镜的观察
        2.2.5 包涵体的分离与溶解
            2.2.5.1 包涵体的分离
            2.2.5.2 包涵体的洗涤
            2.2.5.3 包涵体的溶解
        2.2.6 包涵体的复性及复性后蛋白的浓缩
            2.2.6.1 包涵体的复性
            2.2.6.2 复性后蛋白的浓缩
        2.2.7 复性浓缩后蛋白激光扫描共聚焦显微镜的观察
3 结果
    3.1 pET28a-PCV3-Cap-EGFP重组质粒的构建
        3.1.1 pET28a-PCV3-Cap-EGFP重组质粒的提取鉴定结果
        3.1.2 pET28a-PCV3-Cap-EGFP重组质粒构建后的质粒图谱
        3.1.3 pET28a-PCV3-Cap-EGFP重组质粒的测序结果
    3.2 重组质粒诱导条件的优化
        3.2.1 IPTG浓度对蛋白表达的影响
        3.2.2 诱导时间对蛋白表达的影响
        3.2.3 诱导温度对蛋白表达的影响
    3.3 重组质粒菌液激光扫描共聚焦显微镜的观察
    3.4 包涵体的分离溶解、复性和浓缩
    3.5 复性浓缩后蛋白激光扫描共聚焦显微镜的观察
4 讨论
5 结论
致谢
参考文献
附录一
附录二
作者简介



本文编号：3986341