PRRSV感染诱导细胞自噬及内质网应激的机制研究

发布时间：2025-02-05 15:16

　　细胞自噬是一种溶酶体依赖性的降解途径,在维持细胞内环境稳定的过程中发挥着重要作用。越来越多的研究显示,细胞自噬在不同病毒感染的过程中扮演着不同的角色,同样病毒对细胞自噬的调控机制也不尽相同。此外,细胞自噬还跟天然免疫存在着密切的关系。 内质网是蛋白质合成的重要场所,在蛋白的翻译和修饰过程中发挥着重要作用,病毒复制过程中往往导致大量未折叠或错误折叠蛋白的堆积而引起内质网应激,进而诱导未折叠蛋白反应(UPR), UPR同样跟病毒的增殖存在重要的关系。此外,UPR可以调控细胞自噬的水平。 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)以引起妊娠母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为主要特征,具有较高的死亡率。尽管随着研究的深入取得了一系列的研究成果,但针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的免疫抑制及其对细胞的具体调控机制仍不甚明了。鉴于此,本研究深入探讨了PRRSV感染后自噬及内质网应激的诱导情况。主要研究内容包括： 1. PRRSV感染诱导自噬体的形成 为确定PRRSV感染是否诱导自噬体的形成,首先通过Western Blot的方法检测PRRSV感染后II型微管结合蛋白轻链3(L...

【文章页数】：112 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
第1章 文献综述
    1.1 自噬研究进展
        1.1.1 自噬的种类及过程
        1.1.2 细胞自噬的分子机制
        1.1.3 自噬的信号调节
    1.2 细胞自噬的研究方法
        1.2.1 自噬体的形成
        1.2.2 自噬体的降解
    1.3 自噬与免疫及病毒感染
        1.3.1 自噬与病毒感染
        1.3.2 自噬与免疫
        1.3.3 自噬与内质网应激
    1.4 内质网应激概述
        1.4.1 未折叠蛋白反应的途径
        1.4.2 内质网应激与病毒感染
        1.4.3 内质网应激与细胞凋亡
        1.4.4 内质网应激反应和疾病
    1.5 猪繁殖与呼吸综合征研究进展
第2章 研究目的与意义
第3章 材料与方法
    3.1 实验材料
        3.1.1 细胞、毒株、菌株
        3.1.2 载体与质粒
        3.1.3 工具酶及主要试剂
        3.1.4 抗体、si RNA及主要化学试剂
        3.1.5 培养基与抗生素及其配制
        3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制
        3.1.7 主要实验仪器及设备
        3.1.8 分子生物学分析软件
    3.2 实验方法
        3.2.1 表达质粒的构建
        3.2.2 Western Blot实验
        3.2.3 siRNA及质粒转染
        3.2.4 间接免疫荧光
        3.2.5 Lyso-Tracker Red染色
        3.2.6 激光共聚焦显微镜观察
        3.2.7 双荧光素酶检测实验
        3.2.8 MTS法检测细胞活性
        3.2.9 透射电镜
        3.2.10 荧光定量、半定量PCR
        3.2.11 统计学方法
第4章 结果与分析
    4.1 PRRSV感染诱导自噬体的形成
        4.1.1 EGFP-LC3融合表达质粒的构建
        4.1.2 PRRSV感染MARC-145细胞后LC3的表达变化
        4.1.3 PRRSV感染MARC-145细胞诱导自噬体的形成
        4.1.4 电镜观察PRRSV感染MARC-145细胞后自噬体的形成
    4.2 PRRSV感染促进自噬体的降解
        4.2.1 Lyso-Tracker和LC3的共定位分析
        4.2.2 LC3-Ⅱ的周转分析
        4.2.3 p62的降解分析
    4.3 细胞自噬促进PRRSV增殖
        4.3.1 诱导细胞自噬促进PRRSV的增殖
        4.3.2 抑制细胞自噬抑制PPRSV的增殖
        4.3.3 干扰细胞自噬相关基因抑制PRRSV的增殖
        4.3.4 阻断自噬体的降解抑制PRRSV增殖
    4.4 PRRSV诱导细胞自噬的机制研究
    4.5 抑制细胞自噬PRRSV对干扰素的抑制得到恢复
    4.6 PRRSV感染诱导内质网应激
        4.6.1 PRRSV引起内质网肿胀
        4.6.2 PRRSV感染诱导内质网应激反应
    4.7 PRRSV感染MARC-145细胞激活PERK途径
        4.7.1 PRRSV感染透导eIF2α的磷酸化
        4.7.2 PRRSV感染MARC-145细胞激活ATF4的表达
        4.7.3 PRRSV感染MARC-145细胞激活GADD34的表达
    4.8 PRRSV感染MARC-145细胞激活IRE1途径
        4.8.1 PRRSV感染MARC-145细胞激活Xbp1 mRNA的切割
        4.8.2 PRRSV感染MARC-145细胞激活ERSE和UPRE
        4.8.3 PRRSV感染MARC-145细胞激活EDEM的表达
    4.9 PRRSV感染MARC-145细胞不激活ATF6途径
        4.9.1 PRRSV感染MARC-145细胞不能诱导ATF6的切割
        4.9.2 PRRSV感染MARC-145细胞不能激活ATF6诱导的伴侣分子的表达
    4.10 内质网应激促进PRRSV增殖
        4.10.1 缓解内质网应激抑制PRRSV的增殖
        4.10.2 干扰UPR抑制PRRSV的增殖
    4.11 PRRSV感染介导内质网应激诱导的细胞凋亡
        4.11.1 PRRSV感染激活CHOP启动子
        4.11.2 PRRSV感染激活CHOP mRNA的表达
        4.11.3 PRRSV感染激活CHOP诱导的caspase 3的表达
    4.12 抑制内质网应激抑制了PRRSV诱导的细胞自噬
        4.12.1 4-PBA处理抑制细胞自噬
        4.12.2 干扰PERK和IRE1抑制细胞自噬
第5章 讨论与结论
    5.1 讨论
        5.1.1 PRRSV感染MARC-145细胞诱导完全细胞自噬
        5.1.2 细胞自噬促进PRRSV的增殖
        5.1.3 PRRSV诱导的细胞自噬与天然免疫的关系
        5.1.4 PRRSV感染诱导内质网应激反应
        5.1.5 内质网应激反应促进PRRSV增殖
        5.1.6 PRRSV感染诱导内质网应激介导的细胞凋亡
        5.1.7 PRRSV感染诱导内质网应激调控细胞自噬
    5.2 结论
参考文献
致谢
附录



本文编号：4030040