鸭干扰素刺激基因的克

发布时间：2025-02-11 19:02

　　 本研究旨在克隆、表达鸭干扰素刺激基因(interferon-induced proteins with tetratricopeptide repeats 5,IFIT5)并制备其多克隆抗体。根据GenBank公布的绿头鸭IFIT5(登录号:KF956064)序列设计特异性引物,PCR扩增获得鸭IFIT5基因,并构建原核表达重组质粒pET-30a-IFIT5和pET-32a-IFIT5及真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFIT5。原核表达获得鸭IFIT5重组蛋白后,进行SDS-PAGE分析,并利用镍柱亲和层析方法对重组蛋白进行纯化。以纯化的鸭IFIT5重组蛋白为免疫原制备兔抗鸭IFIT5多克隆抗体。利用间接ELISA测定多克隆抗体效价、用Western blotting鉴定其特异性;将真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFIT5转化BHK21细胞,通过间接免疫荧光法鉴定多克隆抗体的反应性。结果表明:目的蛋白主要以包涵体的形式存在;制备的兔抗鸭IFIT5多克隆抗体效价达1∶49 600,可特异性识别鸭IFIT5重组蛋白,间接免疫荧光试验则表明纯化的多克隆抗体可特异性识别BHK21瞬时真...

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【部分图文】：

图1 鸭IFIT5基因的克隆及鉴定

以实验室保存的鸭外周血淋巴细胞cDNA为模板,PCR扩增得到鸭IFIT5基因。1.0%琼脂糖凝胶电泳结果显示,在退火温度为50℃时出现明显的特异性目的条带,约1440bp(图1A)。经大体系PCR、切胶回收后连接至pMD18-T载体上,获得重组质粒pMD18-T-IFIT5....

图2 鸭IFIT5基因的克隆及原核表达重组质粒的鉴定

以重组质粒pMD-18T-IFIT5为模板,PCR扩增获得含有Kozak序列的IFIT5基因,约1440bp(图3A),并将其连接到pcDNA3.1(+)载体上,获得真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFIT5,该质粒经酶切鉴定,获得大小约为5460bp和1440bp....

图3 含有Kozak序列IFIT5基因的克隆及真核表达重组质粒的鉴定

图2鸭IFIT5基因的克隆及原核表达重组质粒的鉴定2.4鸭IFIT5基因的诱导表达及表达形式分析

图4 鸭IFIT5基因的原核表达及表达形式分析

将pET-30a(+)、pET-32a(+)空载体及重组质粒pET-30a-IFIT5、pET-32a-IFIT5转化Rosetta感染态细胞,IPTG对重组蛋白进行诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式,其中,重组蛋白pET-30a-IFIT5大小为58.7ku左右....

本文编号：4033717