MiR-127-3p在C2C12成肌细胞增殖和分化的作用及调控机制的研究

发布时间：2017-05-30 09:08

  本文关键词：MiR-127-3p在C2C12成肌细胞增殖和分化的作用及调控机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：Micro RNAs(miRNAs)是一类小非编码RNA,其在骨骼肌生长发育调控中发挥重要作用。本文首先建立了山羊miR-127-3p的组织表达谱,分析了其在不同肌肉表型的山羊品种间组织表达差异,初步明确了miR-127-3p与骨骼肌表型的关系。其次,应用miR-127-3p的慢病毒载体(mimic和inhibitor)分别转染处于增殖、分化阶段的C2C12细胞,qPCR法检测了培养第3天和第5天C2C12细胞内肌源性标记基因MyoD,MyoG和Myosin的动态表达,并对C2C12细胞组织形态学进行了检测分析,对miR-127-3p的生肌效应进行了体外实验验证分析。为阐明miR-127-3p生肌调控机理,构建了miR-127-3p靶基因荧光素酶报告载体,通过荧光素酶报告载体系统验证了Vamp2和Sept7是miR-127-3p的靶基因,揭示了miR-127-3p对成肌细胞增殖和分化的作用机制。主要结果如下:1、miR-127-3p是一个在山羊组织中广泛表达的miRNA;miR-127-3p在波尔山羊和巫山黑山羊中的肌肉,脾,心和皮肤组织中高表达,而在肺,肾和肝组织中表达量低,特别是miR-127-3p在波尔山羊肌肉组织中的表达量高于巫山黑山羊。2、miR-127-3p的表达随着成肌细胞的增殖呈增加的趋势,第5天达到最高;在C2C12细胞转染miR-127-3p mimic的第3天和第5天:与对照组相比,肌源性标记基因MyoD、MyoG和Myosin mRNA表达降低,肌细胞增殖减慢;干扰miR-127-3p后,肌源性标记基因MyoD、MyoG和Myosin mRNA表达升高,肌细胞增殖加快。3、miR-127-3p的表达随着C2C12细胞分化逐渐增加,第5天达到最高值;进行诱导分化的第3天和第5天:与对照组相比,转染miR-127-3p mimic的成肌细胞的融合指数(或分化指数)增加,生肌分化标记基因MyoD、MyoG和Myosin mRNA表达升高。干扰miR-127-3p后,肌管的形成减少,成肌细胞融合指数和(或)分化指数降低,生肌分化标记基因MyoD、MyoG和Myosin mRNA表达降低。4、构建了候选靶基因Vamp2和Sept7的荧光素酶报告载体并与miR-127-3p mimic共转了293T细胞,发现miR-127-3p可高效结合Vamp2和Sept7的3′UTR端序列。随后将miR-127-3p的慢病毒载体(mimic和inhibitor)分别转染C2C12成肌细胞,结果发现miR-127-3p可高效抑制Vamp2和Sept7的表达。这表明miR-127-3p是通过调控靶基因Vamp2和Sept7的表达来影响C2C12细胞的增殖、分化进程的。
【关键词】：miR-127-3p C2C12细胞 山羊 生肌调控 靶基因
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S827
【目录】：

• 论文部分缩写词的中英文对照3-4
• 摘要4-6
• SUMMARY6-11
• 第一章 文献综述11-23
• 1 肌肉发育与形成机制11-16
• 1.1 肌肉的形成及发育11-12
• 1.2 骨骼肌发生过程中的生肌调控因子12-16
• 1.2.1 生肌调控因子（myogenic regulatory factors，MRFS）12-13
• 1.2.2 成肌细胞增强因子 2（Myocyte enhancer factor2，，MEF2）13-14
• 1.2.3 Pax基因 (Paired box，Pax)14-15
• 1.2.4 肌肉生长抑制因子 (Myostatin，MSTN)15-16
• 2 miRNA生物学特征16-22
• 2.1 miRNA的发现16
• 2.2 miRNA的生成16-17
• 2.3 miRNA的作用机制17-18
• 2.4 miRNA与骨骼肌发育的关系18-20
• 2.5 miRNA调控肌纤维类型20-21
• 2.6 miR1273p的研究现状21-22
• 3 研究目的及意义22-23
• 第二章 试验研究23-64
• 试验一 miR1273p保守性及组织表达分析23-30
• 1 材料与方法23-27
• 1.1 试验材料23-24
• 1.1.1 组织样品23
• 1.1.2 仪器设备23-24
• 1.1.3 试剂耗材24
• 1.2 方法24-27
• 1.2.1 组织样品采集24
• 1.2.2 总RNA的提取及检测24-25
• 1.2.3 RNA的质量检测25-26
• 1.2.4 RT-qPCR检测miR1273p的表达26-27
• 2 结果与分析27-28
• 2.1 miR1273p序列的同源性分析27
• 2.2 miR1273p在不同山羊品种间的组织表达谱27-28
• 3 讨论28-30
• 试验二 miR1273p对C2C12成肌细胞增殖和分化的作用30-50
• 1 材料与方法30-35
• 1.1 试验材料30-31
• 1.1.1 细胞系30
• 1.1.2 仪器设备30-31
• 1.1.3 试剂耗材31
• 1.2 方法31-35
• 1.2.1 C2C12细胞培养31-32
• 1.2.2 miR1273p模拟物/抑制剂转染C2C12成肌细胞32
• 1.2.3 融合指数和分化指数计数32
• 1.2.4 RT-qPCR检测miR1273p的表达32-33
• 1.2.5 RT-qPCR检测肌源性标记基因mRNA的变化33-35
• 2 结果与分析35-48
• 2.1 miR1273p对C2C12成肌细胞增殖的影响35-41
• 2.1.1 miR1273p在C2C12成肌细胞增殖过程中的动态变化35-36
• 2.1.2 过表达miR1273p抑制C2C12成肌细胞增殖36-39
• 2.1.3 干扰miR1273p促进C2C12成肌细胞增殖39-41
• 2.2 miR1273p对C2C12成肌细胞分化的影响41-48
• 2.2.1 miR1273p在C2C12成肌细胞分化不同时期的动态变化41-42
• 2.2.2 过表达miR1273p促进C2C12细胞成肌分化42-45
• 2.2.3 干扰miR1273p抑制C2C12细胞生肌分化45-48
• 3 讨论48-50
• 试验三 miR1273p的靶基因分析与鉴定50-64
• 1 材料与方法51-59
• 1.1 试验材料51-53
• 1.1.1 细胞系51
• 1.1.2 菌株及载体51-52
• 1.1.3 仪器设备52
• 1.1.4 试剂耗材52
• 1.1.5 常用溶液配制52-53
• 1.1.6 分子生物学相关软件53
• 1.2 方法53-59
• 1.2.1 生物信息学预测miR1273p靶基因53-54
• 1.2.2 靶基因野生型和突变型的 3′UTR的扩增54
• 1.2.3 靶基因野生型和突变型的 3′UTR片段胶回收54-55
• 1.2.4 靶基因野生型和突变型的 3′UTR片段双酶切55-56
• 1.2.5 靶基因野生型和突变型的 3′UTR片段连接56
• 1.2.6 靶基因野生型和突变型的 3′UTR片段转化56-57
• 1.2.7 质粒的提取57-58
• 1.2.8 双荧光素酶报告基因检测试验58-59
• 2 结果与分析59-62
• 2.1 利用软件预测miR1273p的靶基因59
• 2.2 miR1273p抑制其靶基因荧光素酶活性59-60
• 2.3 miR1273p抑制其靶基因mRNA的表达60-62
• 3 讨论62-64
• 结论64-65
• 本研究获得的结果64
• 本研究的创新点与特色64-65
• 参考文献65-74
• 致谢74-75
• 个人简介75-76
• 导师简介76-77

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