WNT信号通路对猪卵母细胞体外成熟的影响

发布时间：2017-06-07 16:02

  本文关键词：WNT信号通路对猪卵母细胞体外成熟的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：卵母细胞与雄性配子不同,其可在体外条件下进行培养并发育成熟,同时其在生殖医学、细胞生物学、物种保护等领域都是重点研究对象。但是在卵母细胞体外培养成熟的过程中,卵母细胞一旦离开卵泡环境就会发生自发性核成熟,从而造成核成熟、质成熟的不同步,因而体外培养成熟的卵母细胞在质和量上都不如体内培养成熟的卵子。WNT信号通路组成复杂,并参与调控多种细胞活动,如细胞命运决定、分化、活力、增殖和凋亡,甚至是胚胎发育。目前,关于WNT信号通路对猪卵母细胞成熟的作用及机理仍有待研究,其对卵母细胞成熟的作用尚不明确。为了探究WNT信号通路对猪卵母细胞成熟的机制,本试验在优化猪卵母细胞体外成熟培养体系的同时,以猪卵丘卵母细胞复合体和猪颗粒细胞为研究对象,采用WNT/β-catenin通路特异性抑制剂FH535和WNT-p38MAPK抑制剂SB202190干扰WNT信号通路,试图揭示WNT信号通路对猪卵母细胞体外成熟的影响。主要获得如下结果:1.建立了成熟率为65%,卵裂率为45.5%,囊胚率为15.1%的猪卵母细胞体外成熟培养体系。该体系具体组成为:在TCM199基础培养液中添加10%胎牛血清(FBS)、10%猪卵泡液(PFF)、100 IU/mL双抗(青霉素+链霉素)、10 ng/mL表皮生长因子(EGF)、0.57 mM L-半胱氨酸(L-Cys)、2.5 IU/mL卵泡刺激素(FSH)、10 IU/mL孕马血清素(PMSG)、10 IU/mL人绒毛膜促性腺激素(HCG)、0.91 mM丙酮酸钠、3.05 mM葡萄糖和0.1 g/L聚乙烯醇(PVA)。培养方法使用敞开式凹槽玻璃皿培养法,激素作用方式使用44 h持续作用。2.在猪卵母细胞体外培养的成熟培养基中添加WNT/β-catenin通路的抑制剂(FH535),对猪卵丘卵母细胞复合体(COCs)进行体外培养。结果揭示,体外添加浓度为1μM的FH535可以显著提高猪卵母细胞达到MII期的百分比(P0.05),此外猪卵母细胞的卵裂率与囊胚率得到提高(P0.05),囊胚内细胞核的数量也有所增加(P0.05)。通过实时定量PCR和Western Blot分析,发现WNT信号通路的抑制能够明显促进Cdc-2、Bmp-15和Mos的基因的表达,并降低Gdf-9的表达(P0.05);β-catenin的基因表达未发生明显变化,但是其蛋白水平的表达却明显受到抑制(P0.05)。由此表明,WNT/β-catenin特异性抑制剂FH535对WNT信号通路的抑制对猪卵母细胞的成熟具有促进作用。3.在体外成熟培养基中添加p38MAPK的抑制剂(SB202190)并对猪卵丘卵母细胞复合体(COCs)进行体外培养。通过体视显微镜观察和实时定量PCR检测,结果表明,体外添加浓度为20μM的SB202190明显抑制了卵丘细胞的扩散。在经SB202190处理后β-catenin、Cdc-2、Bmp-15、Cyclin B1、Mos和p34的表达显著降低(P0.05),但Gdf-9的表达与对照组无明显差异(P0.05)。通过Western Blot的检验,添加SB202190后,猪卵母细胞中P38MAPK的表达量显著减少,其磷酸化的水平也明显降低(P0.05)。4.在体外培养猪颗粒细胞时,分别添加0、1、10和20μM的p38MAPK特异性抑制剂SB202190。通过CCK-8试剂盒检测猪颗粒细胞的生长活性,通过试剂盒检测猪颗粒细胞的凋亡及周期状况,实时定量PCR检测生长、凋亡相关基因表达。结果显示添加SB202190抑制了猪颗粒细胞的生长活性,且在添加20μM时差异显著(P0.05);但是对猪颗粒细胞的凋亡未产生明显影响,并与对照组比较发现大部分细胞被阻滞在G1/G0期,两组间存在显著性差异(P0.05)。实时定量PCR结果揭示,在加入SB202190后,Bax、Bcl-2和P27表达量显著增加(P0.05),而Bcl-2和Bax的比值变化不显著(P0.05),Fas、Fasl和Cdk-4的表达受到显著的抑制(P0.05)。通过Western Blot分析,添加SB202190后,猪颗粒细胞p38MAPK的含量显著减少(P0.05),其磷酸化的水平未发生改变。综上所述,本试验已建立能获得较高的成熟率和卵裂率的猪卵母细胞体外成熟培养体系,且在体外培养猪卵母细胞时添加1μM的WNT/β-catenin特异性抑制剂FH535可以促进猪卵母细胞的成熟及提高其早期胚胎发育的能力,而在体外培养猪卵母细胞时添加20μMSB202190可通过抑制p38MAPK表达阻断WNT信号通路从而抑制猪卵母细胞的成熟,体外培养猪卵泡颗粒细胞时20μM SB202190可通过阻滞其周期从而抑制其生长活性。
【关键词】：WNT信号通路 猪卵母细胞 体外成熟 抑制剂 猪颗粒细胞
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-15
• 文献综述15-31
• 第一章 卵母细胞的成熟与早期胚胎培养研究进展15-25
• 1.1 卵母细胞的发生与成熟15-16
• 1.2 影响卵母细胞体外成熟的因素16-20
• 1.2.1 卵母细胞的来源16-18
• 1.2.2 培养条件18
• 1.2.3 其他影响因素18-20
• 1.3 卵母细胞体外成熟培养的研究进展20
• 1.4 卵母细胞的体外成熟培养系统20-21
• 1.4.1 微滴培养系统20-21
• 1.4.2 开放培养系统21
• 1.4.3 密闭培养系统21
• 1.5 卵母细胞微环境——卵母细胞与颗粒细胞之间的相互作用21-24
• 1.5.1 卵母细胞对卵丘细胞及颗粒细胞的影响21-22
• 1.5.2 卵丘细胞在卵母细胞成熟发育中的作用22-23
• 1.5.3 卵丘细胞与卵母细胞的旁分泌与缝隙连接作用23-24
• 1.6 卵母细胞激活与早期胚胎的发育24-25
• 第二章 Wnt信号通路对卵母细胞发育的的影响25-31
• 2.1 WNT对反转发育、生理和病理过程的调节25
• 2.2 WNT信号诱导25-27
• 2.3 出生后卵巢的WNT信号调节27-28
• 2.4 WNT信号通路抑制剂与激活剂28-30
• 2.5 目前存在的主要问题及本研究的意义30-31
• 试验研究31-66
• 第三章 猪卵母细胞体外成熟培养体系的建立31-41
• 3.1 前言31
• 3.2 材料与方法31-35
• 3.2.1 猪卵巢采集31-32
• 3.2.2 主要仪器与用品32
• 3.2.3 主要化学试剂32
• 3.2.4 试剂的配制32-33
• 3.2.5 猪卵母细胞的收集与培养33
• 3.2.6 猪卵母细胞的成熟和孤雌激活后卵裂率的观察33-34
• 3.2.7 不同培养方法培养猪卵母细胞34
• 3.2.8 不同浓度激素配伍培养猪卵母细胞34
• 3.2.9 不同浓度EGF培养猪卵母细胞34-35
• 3.2.10不同激素处理方式培养猪卵母细胞35
• 3.2.11统计分析方法35
• 3.3 结果与分析35-38
• 3.3.1 不同培养方法对猪卵母细胞成熟的影响35-36
• 3.3.2 不同浓度激素配伍对猪卵母细胞成熟的影响36-37
• 3.3.3 不同浓度EGF对猪卵母细胞成熟的影响37-38
• 3.3.4 不同激素处理方式对猪卵母细胞成熟的影响38
• 3.4 讨论38-40
• 3.4.1 培养方法对猪卵母细胞成熟的影响38-39
• 3.4.2 不同激素配伍对猪卵母细胞成熟的影响39
• 3.4.3 EGF对猪卵母细胞成熟的影响39
• 3.4.4 激素处理方式对猪卵母细胞成熟的影响39-40
• 3.5 小结40-41
• 第四章 抑制剂FH535对猪卵母细胞成熟的影响41-51
• 4.1 前言41-42
• 4.2 材料与方法42-45
• 4.2.1 猪卵巢采集42
• 4.2.2 主要仪器与用品42
• 4.2.3 主要试剂42
• 4.2.4 试剂的配制42
• 4.2.5 猪卵母细胞的收集与培养42-43
• 4.2.6 猪卵母细胞成熟的观察43
• 4.2.7 猪卵母细胞孤雌激活及早期胚胎发育的观察43
• 4.2.8 猪卵母细胞母系基因的检测43-44
• 4.2.9 β-catenin蛋白的表达44
• 4.2.10 统计分析方法44-45
• 4.3 结果与分析45-49
• 4.3.1 抑制剂FH535对卵丘扩散的影响45
• 4.3.2 抑制剂FH535对猪卵母细胞成熟的影响45-47
• 4.3.3 抑制剂FH535对猪卵母细胞母系基因表达的影响47-48
• 4.3.4 抑制剂FH535对猪卵母细胞WNT信号通路 β-catenin表达的影响48-49
• 4.4 讨论49-50
• 4.4.1 抑制剂FH535对卵丘扩散和猪卵母细胞成熟的影响49
• 4.4.2 抑制剂FH535对猪卵母细胞母系基因表达的影响49-50
• 4.4.3 抑制剂FH535对猪卵母细胞WNT信号通路 β-catenin表达的影响50
• 4.5 小结50-51
• 第五章 抑制剂SB202190对猪卵母细胞成熟的影响51-57
• 5.1 前言51
• 5.2 材料与方法51-52
• 5.2.1 猪卵巢采集51
• 5.2.2 主要仪器与用品51
• 5.2.3 主要试剂51-52
• 5.2.4 试剂的配制52
• 5.2.5 猪卵母细胞的收集与培养52
• 5.2.6 猪卵母细胞成熟的观察52
• 5.2.7 猪卵母细胞母系基因的检测52
• 5.2.8 p38MAPK和p-p38MAPK蛋白的表达52
• 5.2.9 统计分析方法52
• 5.3 结果与分析52-55
• 5.3.1 抑制剂SB202190对猪卵母细胞卵丘扩散的影响52-53
• 5.3.2 抑制剂SB202190对猪卵母细胞成熟的影响53
• 5.3.3 抑制剂SB202190对猪卵母细胞母系基因表达的影响53-54
• 5.3.4 抑制剂SB202190对猪卵母细胞p38MAPK/p-p38MAPK表达的影响54-55
• 5.4 讨论55-56
• 5.4.1 抑制剂SB202190对猪卵母细胞卵丘扩散和猪卵母细胞成熟的影响55-56
• 5.4.2 抑制剂SB202190对猪卵母细胞母系基因表达的影响56
• 5.4.3 抑制剂SB202190对猪卵母细胞p38MAPK/p-p38MAPK表达的影响56
• 5.5 小结56-57
• 第六章 抑制剂SB202190对猪卵母细胞微环境-猪颗粒细胞作用的研究57-66
• 6.1 前言57
• 6.2 材料与方法57-60
• 6.2.1 猪卵巢的采集57
• 6.2.2 试剂和仪器57-58
• 6.2.3 猪颗粒细胞的分离与培养58
• 6.2.4 猪颗粒细胞的鉴定58
• 6.2.5 抑制剂SB202190对猪颗粒细胞生长的影响58
• 6.2.6 抑制剂SB202190对猪颗粒细胞凋亡的影响58
• 6.2.7 抑制剂SB202190对猪颗粒细胞周期的影响58-59
• 6.2.8 抑制剂SB202190对猪颗粒细胞相关基因表达的影响59
• 6.2.9 抑制剂SB202190对猪颗粒细胞p38MAPK/p-p38MAPK表达的影响59-60
• 6.2.10统计分析方法60
• 6.3 结果与分析60-64
• 6.3.1 猪卵巢颗粒细胞培养及形态学观察60-61
• 6.3.2 猪卵巢颗粒细胞的鉴定61
• 6.3.3 抑制剂SB202190处理对猪卵巢颗粒细胞增殖活力的影响61
• 6.3.4 抑制剂SB202190处理对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响61-62
• 6.3.5 抑制剂SB202190对猪卵巢颗粒细胞周期的影响62
• 6.3.6 抑制剂SB202190对猪颗粒细胞凋亡、周期相关基因表达的影响62-63
• 6.3.7 抑制剂SB202190对猪颗粒细胞p38MAPK/p-p38MAPK表达的影响63-64
• 6.4 讨论64-65
• 6.4.1 抑制剂SB202190对猪颗粒细胞生长、凋亡、周期的影响64
• 6.4.2 抑制剂SB202190对猪颗粒细胞凋亡、周期相关基因表达的影响64
• 6.4.3 抑制剂SB202190对猪颗粒细胞p38MAPK/p-p38MAPK表达的影响64-65
• 6.5 小结65-66
• 结论66-67
• 创新点67-68
• 参考文献68-78
• 缩略词78-79
• 致谢79-80
• 作者简介80

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张德福,Karl Schellander;猪卵母细胞电激活参数的研究[J];上海交通大学学报(农业科学版);2001年04期

2 姜国诚,秦鹏春;猪卵母细胞的体外培养及死活鉴别[J];畜牧兽医学报;1989年03期

3 苏友强,夏国良,陈勇,赫晨,傅国栋;次黄嘌呤对猪卵母细胞体外自发成熟抑制作用的研究[J];畜牧兽医学报;2000年01期

4 唐莉;透明质酸酶在猪卵母细胞体外受精时对单精子受精穿透力的影响[J];国外医学(计划生育分册);2000年04期

5 傅国栋,张似青,夏国良;猪卵母细胞体外成熟的无血清培养模型的建立[J];上海农业学报;2001年04期

6 张德福,王英,陈茵,王凯,Karl Schellander ,Lin Cai lu;应用电脉冲刺激激活猪卵母细胞的研究[J];上海实验动物科学;2002年03期

7 卢晟盛,卢克焕;促性腺激素对猪卵母细胞体外成熟的影响[J];西南农业大学学报(自然科学版);2004年06期

8 胡军和,杨春荣,窦忠英;猪卵母细胞在不同条件下的体外成熟培养[J];农业生物技术学报;2005年05期

9 张德福;刘东;王邵凯;王少兵;芮荣;汤琳琳;;猪卵母细胞、胚胎玻璃化冷冻初步研究[J];中国畜禽种业;2005年11期

10 张德福;刘东;王邵凯;王少兵;芮荣;汤琳琳;;猪卵母细胞、胚胎玻璃化冷冻初步研究(续上期)[J];中国畜禽种业;2005年12期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 刘红波;吕培茹;胡林林;杨小淦;左二伟;宁淑芳;韩晓慧;陆阳清;卢晟盛;卢克焕;;基于近红外拉曼光谱的猪卵母细胞激活人工智能监控体系的初步建立[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集（上册）[C];2010年

2 张玲;卢晟盛;黄友防;许惠艳;兰宗宝;房慧伶;;猪卵母细胞电激活的研究[A];中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十五次学术研讨会论文集[C];2008年

3 田允波;许丹宁;孟彦举;陈学进;;不同基础培养液对猪卵母细胞体外成熟的影响[A];中国畜牧兽医学会兽医产科学分会第五届全体会议第十次学术研讨会论文集[C];2009年

4 王慧利;孟春花;张庆晓;李静心;苏磊;贺强;朱前明;曹少先;;猪卵母细胞体外成熟及胚胎体外发育系统的优化[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十六届学术研讨会论文集[C];2012年

5 陈晓宇;李青旺;夏凡;龙玲;赵红卫;韩增胜;张德福;;不同添加物对猪卵母细胞体外成熟的影响[A];全国首届动物生物技术学术研讨会论文集[C];2004年

6 徐利;戴建军;张廷宇;吴彩凤;张树山;张德福;顾晓龙;李翔;韩晓;李芳芳;;红景天多糖对猪卵母细胞体外成熟及其发育潜力的影响[A];上海市制冷学会2013年学术年会论文集[C];2013年

7 付博;赵金凤;房庆昌;任亮;马红;李忠秋;郭镇华;刘娣;;不同激活方式对猪卵母细胞孤雌发育的影响[A];中国动物遗传育种研究进展——第十五次全国动物遗传育种学术讨论会论文集[C];2009年

8 聂尊阳;谭禄彬;曾申明;;外源性致热原脂多糖对猪卵母细胞影响的初步研究[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十六届学术研讨会论文集[C];2012年

9 吴国权;贾宝瑜;李俊杰;岳明星;杜明;王亮;朱士恩;;L-肉碱对猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活早期胚胎发育能力的影响[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集（上册）[C];2010年

10 李莉;郑新民;华再东;刘西梅;毕延震;肖红卫;;猪卵母细胞不同孤雌激活方法的研究[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十六届学术研讨会论文集[C];2012年

中国博士学位论文全文数据库 前9条

1 张羽;猪卵母细胞极体排出与早期胚胎卵裂的分子调控[D];南京农业大学;2014年

2 武彩红;猪卵母细胞的超低温冷冻保存及影响其冻后发育能力的机理研究[D];南京农业大学;2006年

3 陈晓宇;体外共培养体系在猪卵母细胞核质同步成熟、受精以及胚胎发育中的研究[D];西北农林科技大学;2006年

4 贾宝瑜;共轭亚油酸对猪卵母细胞体外成熟、胚胎培养和冷冻保存的作用机制[D];中国农业大学;2014年

5 马红;猪体细胞核移植及体外受精技术的研究[D];东北农业大学;2010年

6 卢晟盛;影响猪体外受精因素的研究[D];广西大学;2003年

7 高飞;WT1基因下调对猪卵母细胞和早期胚胎发育的影响[D];吉林大学;2014年

8 张瑞娜;猪卵母细胞成熟过程中Perilipins和PPARγ作用机制的研究[D];中国农业大学;2015年

9 刘丽清;猪卵母细胞和早期胚胎中c-mos和Oct-4基因表达以及RNAi研究[D];东北农业大学;2007年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 吴霞;猪卵母细胞脂质相关基因表达谱研究[D];四川农业大学;2011年

2 李琴;褪黑激素对猪卵母细胞体外发育的影响[D];西南大学;2015年

3 崔晶晶;不同处理对猪卵母细胞透明带泛素化水平的影响[D];延边大学;2015年

4 张振南;褪黑素对热应激猪卵母细胞体外成熟的影响[D];河北农业大学;2015年

5 秦先红;猪卵母细胞内脂滴的发育规律分析[D];四川农业大学;2014年

6 徐国旗;猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎干细胞的分离培养初探[D];青海大学;2016年

7 黄晶晶;猪卵母细胞体外成熟调控和MPF、MAPK基因表达研究[D];天津农学院;2016年

8 陈瑞;CyclinA2在猪卵母细胞完成减数分裂中的作用研究[D];西北农林科技大学;2016年

9 石美虹;WNT信号通路对猪卵母细胞体外成熟的影响[D];西北农林科技大学;2016年

10 农W毞

本文编号：429529