规模化牧场布鲁氏菌病血清学调查与iELISA检测方法的建立

发布时间：2017-06-08 01:08

  本文关键词：规模化牧场布鲁氏菌病血清学调查与iELISA检测方法的建立，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目前我国布鲁氏菌病主要的诊断方法为细菌分离培养和血清学检测,但满足不了快速检测和大群检测的要求,且容易出现假阳性。为了更好的诊断和预防布鲁氏菌病,需要研究新型的检测方法来满足快速和大群检测的要求。1.自2013年1月—2014年12月,本实验室用虎红平板凝集试验的方法对送检和采集的疑似布鲁氏菌病奶牛血清样本进行了检测,初步筛查了奶牛场布鲁氏菌病的流行情况。共计检测奶牛血清样本数为8160份,其中阳性血清样数本为1768份,占检测总样本数的21.67%。流产检测的奶牛血清样本数为898份,其中阳性血清样本数为400份,占流产检测总样本数的44.54%;大群检测的奶牛血清样本数为7262份,其中阳性血清样本数为1368份,占大群检测总样本数的18.84%。2.布鲁氏菌外膜蛋白OMP16有良好的免疫原性,是亚单位疫苗的热门候选。T4SS是布鲁氏菌的胞内寄生所必须的毒力因子。2011年,Marchesini MI等利用CyaA报告系统鉴定BPE123、 BPE275、BPE005和BPE043是由T4SS分泌的效应蛋白。它们在布鲁氏菌胞内运输过程中起到重要的调节作用,其是否具有良好的免疫原性还没有被证明。因此,本试验挑选了OMP16和BPE123两个基因,纯化其重组蛋白,尝试建立间接ELISA检测方法。据GenBank中布鲁氏菌OMP16和BPE123的基因序列,设计特异性引物,扩增OMP16和BPE123基因片段。用OMP16和BPE123基因构建克隆质粒,同时进行双酶切和测序鉴定,阳性质粒命名为pET-T3-OMP16和pET-T3-BPE123。同时对克隆质粒pET-T3-OMP16、pET-T3-BPE123和pET-32a(+)表达质粒进行双酶切。回收目的基因片段OMP16、BPE123以及pET-32a(+)线性片段,用连接酶将它们连接,构建阳性表达质粒pET-32a-OMP16和pET-32a-BPE123。随后将二者转入宿主菌大肠杆菌中,构建表达菌pET-32a-OMP16-BL21和pET-32a-BPE123-BL21。用IPTG诱导构建的表达菌进行表达,并对诱导表达条件进行优化。利用SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定表达的蛋白。用Ni-NTASpin Kit大量纯化并收集重组蛋白。以纯化的蛋白OMP16和BPE123作为包被抗原,尝试构建iELISA检测方法。在尝试试验中确定抗原的最佳包被浓度和最佳包被条件；确定二抗的最佳稀释度以确定及阴阳性临界值,同时确定试验敏感性和试验重复性。用建立的iELISA方法检测245份奶牛血清样本,并与虎红平板凝集试验作对照,判断该方法的符合率。纯化了OMP16和BPE123蛋白,成功构建以OMP16为包被抗原的iELISA检测方法。该检测方法与虎红平板凝集试验的符合率达91.38%。BPE123蛋白在尝试建立iELISA检测方法时,出现多种不能区分阴阳血清的问题,未能成功构建BPE123蛋白的iELISA检测方法。结论：布鲁氏菌病流行病学调查结果显示,布病在全国范围内的许多牧场里都有发生,且发病率有明显的上升趋势；在引起流产因素中,布病是导致奶牛流产很重要的因素。成功构建OMP16的间接ELISA检测方法,可作为奶牛布病血清学检测的候选检测方法；未能成功构建BPE123蛋白的iELISA检测方法,但能够为进一步探索其免疫原性以及在布鲁氏菌胞内寄生过程中的功能奠定基础。
【关键词】：布鲁氏菌 原核表达 OMP16 BPE123 间接ELISA
【学位授予单位】：宁夏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S855.12
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 第一章 引言7-8
• 第二章 文献综述8-16
• 2.1 布鲁氏菌的历史8
• 2.2 布鲁氏菌的致病机理8-9
• 2.3 布鲁氏菌病的传播9
• 2.4 布鲁氏菌病的症状9
• 2.5 布鲁氏菌病的诊断9-12
• 2.6 外膜蛋白(OMP)12-14
• 2.7 Ⅳ型分泌系统14-15
• 2.8 本试验研究的目的和意义15-16
• 第三章 布鲁氏菌病的血清病学调查16-20
• 3.1 试验材料16
• 3.2 试验方法16-17
• 3.3 结果与分析17-20
• 第四章 iELISA检测方法的建立20-37
• 4.1 试验材料20
• 4.2 试验方法20-30
• 4.3 间接ELISA检测方法结果30-37
• 第五章 讨论37-39
• 5.1 关于布鲁氏菌血清学样本37
• 5.2 关于布鲁氏菌血清学调查的分析37
• 5.3 关于布鲁氏菌的防控和净化37-38
• 5.4 关于iELISA检测方法38
• 5.5 关于布鲁氏菌分泌蛋白BPE12338-39
• 第六章 结论39-40
• 6.1 布鲁氏菌病血清学调查39
• 6.2 iELISA检测方法的建立39-40
• 参考文献40-46
• 致谢46-47
• 个人简历47

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 贲百灵,孙广力,娄永利;布鲁氏菌病流行现状和防治建议[J];畜牧兽医科技信息;2005年07期

2 张艳红;康建生;;山西省布鲁氏菌病流行情况及防治对策[J];中国兽医杂志;2008年09期

3 李秋丽;夏蔚;张彤;丁岩峰;;人畜布鲁氏菌病流行特征的数据分析△[J];数理医药学杂志;2008年05期

4 高庆田;;几种布鲁氏菌病诊断方法的比较[J];湖北畜牧兽医;2010年11期

5 白琨;张小书;;内蒙古乌兰察布市2010年布鲁氏菌病疫情专项调查分析[J];当代畜禽养殖业;2011年04期

6 赵凤菊;;布鲁氏菌病的流行情况及危害[J];中国畜牧兽医文摘;2011年02期

7 耿淑梅;;动物布鲁氏菌病的流行特点[J];养殖技术顾问;2011年09期

8 刘超;王向林;张仁富;;布鲁氏菌病概述[J];中国畜牧业;2013年13期

9 黄建中;;家禽布鲁氏菌病——初步报告[J];地方病译丛;1980年02期

10 金根源;;英国的人和牛的布鲁氏菌病[J];地方病译丛;1981年03期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 周继章;宫晓炜;曹小安;陈启伟;郑福英;费媛媛;邱昌庆;;我国部分省(区)动物布鲁氏菌病流行情况调查[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年

2 周继章;宫晓炜;曹小安;郑福英;蔺国珍;王光华;费媛媛;邱昌庆;;2009-2010年我国部分省(区)动物布鲁氏菌病流行情况调查[A];第3届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2011年

3 牛金星;任德新;张鑫荣;;滩羊布鲁氏菌病的检测[A];中国畜牧兽医学会养羊学分会2014年全国养羊生产与学术研讨会议论文集[C];2014年

4 杜美兰;罗秋菊;崔宏伟;贾少菊;;布鲁氏菌病的健康宣教[A];中华护理学会2009全国传染病护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2009年

5 毛开荣;;布鲁氏菌病研究进展[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年

6 刘东立;;抗菌素联合用药治疗布鲁氏菌病效果观察[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年

7 朱匡纪;蔡祖华;邵丰尧;黄秀琴;王菊丛;楼妙芬;;2005年婺城区布鲁氏菌病国家级监测点监测报告[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年

8 叶丽萍;许国章;鲁锋;孙亚维;张吉楠;董红军;;2002～2005年宁波市职业重点人群布鲁氏菌病监测结果分析[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年

9 蒋轶文;白羽;;职业性布鲁氏菌病研究进展[A];中华预防医学会第十八次全国职业病学术交流大会论文汇编[C];2009年

10 郑源强;吴岩;毕力夫;;布鲁氏菌病检测、防控措施与疫苗研究进展[A];2011新型疫苗与抗体创制关键技术及质量控制研讨会论文集[C];2011年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 记者 韦良俊;我区须加强防控布鲁氏菌病[N];阿勒泰日报;2008年

2 中国农业科学院 邱昌庆 研究员;对奶牛布鲁氏菌病防制的思考[N];中国畜牧兽医报;2005年

3 中国农业科学院 邱昌庆研究员;对奶牛布鲁氏菌病防制的思考[N];中国畜牧兽医报;2005年

4 刘朝江;预防人畜共染布鲁氏菌病[N];农民日报;2014年

5 中国兽药监察所 副研究员 毛开荣;羊布鲁氏菌病的防治[N];中国畜牧水产报;2000年

6 记者 蒋中意;我市被卫生部定为布鲁氏菌病检测点[N];金华日报;2005年

7 施水泉邋记者 李水根;确诊布鲁氏菌病有了“快枪手”[N];健康报;2007年

8 记者 马艳军;落实五项措施 控制布鲁氏菌病疫情[N];内蒙古日报(汉);2006年

9 记者 陈艳阳邋通讯员 衣晓峰 时长山;布鲁氏菌病疫情上升值得警惕[N];大众卫生报;2007年

10 张建平;加强布鲁氏菌病的防治[N];河北经济日报;2008年

中国博士学位论文全文数据库 前3条

1 殷德辉;基于多表位融合蛋白的人布鲁氏菌病检测技术研究[D];吉林大学;2016年

2 李向阳;内蒙古通辽地区奶牛布鲁氏菌病流行病学调查和感染机理初步分析[D];吉林大学;2013年

3 甄清;人布鲁氏菌病标准化PCR诊断方法及BP26基因标记疫苗研究[D];吉林大学;2009年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 李秋丽;利用统计方法分析某地区布鲁氏菌病的流行特征[D];东北师范大学;2007年

2 黎银军;我国布鲁氏菌病时空分布及风险预测研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2013年

3 杨志光;中国布鲁氏菌病疫情形势及防治对策[D];中国疾病预防控制中心;2010年

4 韩丹;新疆布鲁氏菌病患者外周血T细胞亚群的临床分析[D];新疆医科大学;2016年

5 王锐泽;2009~2012年吉林省松原市布鲁氏菌病门诊就诊人群流行病学特征分析[D];吉林大学;2016年

6 韦明;规模化牧场布鲁氏菌病血清学调查与iELISA检测方法的建立[D];宁夏大学;2016年

7 伊日盖;布鲁氏菌病的流行病学调查与分子分型研究[D];内蒙古农业大学;2009年

8 常琳;吉林省松原地区布鲁氏菌病就诊人群流行病学调查与分析[D];吉林大学;2010年

9 安建光;白城地区布鲁氏菌病的流行病学调查及病原学研究[D];吉林大学;2007年

10 李明涛;布鲁氏菌病动力学建模与理论分析[D];中北大学;2014年

  本文关键词：规模化牧场布鲁氏菌病血清学调查与iELISA检测方法的建立，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：430873