抗菌肽的重组表达及其生物活性研究

发布时间：2017-06-08 03:10

  本文关键词：抗菌肽的重组表达及其生物活性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：近年来,抗生素的滥用导致耐药性致病菌的进化速度加快,细菌的耐药性已成为世界范围内的健康问题。抗生素在养殖业的应用也加剧了环境污染,药物残留还会引发食品安全问题,因此,人们亟于开发新型抗生素替代传统抗生素。抗菌肽因其作用机制独特、不易产生耐药性、对环境友好等特点使其成为新型抗菌药物及绿色饲料添加剂的热门备选。本研究选取了源于斑节对虾(Penaeus monodon)抗脂多糖因子3(Anti-lipopolysaccharide factor 3,ALFpm3)作为研究对象,成功构建ALFpm3可溶表达质粒pET22b-ALFpm3及自聚集短肽融合表达质粒pET22b-ALFpm3-PT 18A。以多种细菌和真菌做抗菌活性测试,结果表明E.coli origamiB(DE3)重组表达的ALFpm3粗酶液对E.coli DH5α,B.subtilis 168,S.aureus有明显生长抑制作用。粗酶液对E.coli DH5α,B.subtilis 168,S.aureus的抑菌圈直径分别为25 mm,23 mm,13 mm。而ALFpm3-PT 18A未显现出抑菌活性。以镍柱亲和层析纯化获得重组抗菌肽ALFpm3浓度约为23μg/mL。热稳定测试结果显示,重组ALFpm3经100 oC处理3 h后,抑菌活性基本维持不变,表明其具有良好的热稳定性。但鉴于其表达量较低,无法用于大规模制备。以P.pastoris KM71对ALFpm3及源于眼镜蛇(Ophiophagus hannah)毒液抗菌肽OH-CATH构建分泌表达载体。通过Tricine-SDS-PAGE技术,在摇瓶发酵上清液中未检测到ALFpm3及OH-CATH表达;但Western-blot可检测到ALFpm3的表达,但未检测到OH-CATH表达。对含有ALFpm3表达载体的P.pastoris KM71菌株进行高密度上罐发酵,发酵液上清重组蛋白含量约75μg/mL,较大肠杆菌有明显提高,但抑菌活性低于大肠杆菌重组表达所得ALFpm3。本研究表明,来源于斑节对虾的ALFpm3具有一定的抗菌活性和应用潜质,但本研究尝试原核(大肠杆菌)和真核(毕赤酵母)两种表达宿主菌,均未能获得大量有活性的ALFpm3重组肽。建议后续研究中,继续尝试其他宿主菌和表达载体,以进一步研究其生物活性,为其应用开发奠定基础。
【关键词】：抗菌肽 原核表达 真核表达 抑菌活性 上罐发酵
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S816.7
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第一章 绪论10-23
• 1.1 引言10
• 1.2 抗菌肽的分类10-13
• 1.2.1 根据生物活性分类11-12
• 1.2.2 根据结构分类12-13
• 1.3 抗菌肽作用机理13-15
• 1.3.1 细胞膜作用机制13-15
• 1.3.2 胞内作用机制15
• 1.4 抗菌肽耐药机理15-17
• 1.4.1 固有耐受机制15-16
• 1.4.2 可诱导耐受机制16-17
• 1.5 抗菌肽制备17-18
• 1.5.1 化学合成17
• 1.5.2 生物合成17-18
• 1.6 抗菌肽的应用18-20
• 1.6.1 抗菌肽临床研究18-19
• 1.6.2 抗菌肽在水产养殖中的应用19-20
• 1.6.3 抗菌肽在畜牧业中的应用20
• 1.7 论文研究内容及意义20-23
• 1.7.1 研究背景及意义20-21
• 1.7.2 研究内容21-22
• 1.7.3 技术路线22-23
• 第二章 抗菌肽ALFpm3在大肠杆菌中的克隆表达及其生物活性检测23-48
• 2.1 引言23
• 2.2 实验材料23-27
• 2.2.1 菌株与质粒23
• 2.2.2 主要试剂23-24
• 2.2.3 实验仪器24-25
• 2.2.4 常用溶液及培养基配制25-27
• 2.3 实验方法27-34
• 2.3.1 pET22b-ALFpm3的构建27-30
• 2.3.2 pET22b-ALFpm3-PT18A的构建30-33
• 2.3.3 E. coli感受态细胞的制备33
• 2.3.4 pET22b-ALFpm3转化E. coli DH5α33-34
• 2.3.5 重组质粒pET22b-ALFpm3鉴定34
• 2.4 pET22b-ALFpm3转化E.coli origamiB(DE3)34
• 2.5 E.coli origamiB(DE3)/ pET22b-ALFpm3小量表达34-38
• 2.5.1. 小量表达34-35
• 2.5.2 Tricine-SDS-PAGE电泳分析35-36
• 2.5.3 抑菌活性检测36-37
• 2.5.4 镍柱亲和层析纯化ALFpm337-38
• 2.5.5 重组蛋白热稳定性测试38
• 2.6 实验结果与讨论38-47
• 2.6.1 pET22b-ALFpm3质粒构建38-39
• 2.6.2 pET22b-ALFpm3-PT18A质粒构建39-40
• 2.6.3 E.coli origamiB(DE3)/pET22b-ALFpm3生长曲线40-41
• 2.6.4 E. coli origamiB(DE3)/pET22b-ALFpm3-PT 18A生长曲线41-42
• 2.6.5 E. coli origamiB(DE3)/pET22b-ALFpm3诱导表达分析42
• 2.6.6 E. coli origamiB(DE3)/pET22b-ALFpm3-PT 18A诱导表达分析42-43
• 2.6.7 重组蛋白抑菌活性测试43-45
• 2.6.8 重组ALFpm3热稳定性测试45-47
• 2.7 本章小结47-48
• 第三章 抗菌肽在毕赤酵母中的克隆表达及生物活性检测48-66
• 3.1 引言48
• 3.2 实验材料48-52
• 3.2.1 菌株与质粒48
• 3.2.2 主要试剂48-50
• 3.2.3 实验仪器50
• 3.2.4 常用试剂配制50-52
• 3.3 实验方法52-60
• 3.3.1 重组质粒构建52-55
• 3.3.2 重组质粒筛选55-56
• 3.3.3 P. pastoris感受态细胞的制备56
• 3.3.4 P. pastoris电转化56-58
• 3.3.5 重组菌株摇瓶发酵58
• 3.3.6 Western Blot检测58-60
• 3.3.7 重组菌株上罐发酵60
• 3.4 实验结果60-65
• 3.4.1 pPIC9K-ALFpm3-6 His tag质粒构建60-62
• 3.4.2 pPIC9K- OH-CATH-6 His tag质粒构建62-63
• 3.4.3 P. pastoris KM71摇瓶发酵63-64
• 3.4.4 P. pastoris KM71/pPIC9K-ALFpm3-6 His tag上罐发酵64
• 3.4.5 P. pastoris KM71/pPIC9K-ALFpm3-6 His tag上罐发酵上清活性检测64-65
• 3.5 本章小结65-66
• 结论与展望66-68
• 结论66
• 展望66-68
• 参考文献68-75
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果75-76
• 致谢76-77
• 附件77

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