表面展示猪流感病毒NS1乳酸菌pSIP409-pgsA-NS1的制备及其免疫作用的研究

发布时间：2017-06-08 20:17

  本文关键词：表面展示猪流感病毒NS1乳酸菌pSIP409-pgsA-NS1的制备及其免疫作用的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪流感在世界范围内广泛流行,带来了巨大危害和经济损失。如何研制出安全有效的猪流感口服制剂(疫苗)是科研工作者共同要解决的难题。乳酸菌作为一种肠道益生菌不仅具有免疫调节功能,还可作为表达外源蛋白的载体。但由于其所表达的外源蛋白大多在胞内,所以在一定程度上限制了外源蛋白在胞外发挥作用。pgs A是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)多聚谷氨酸合成酶系统PGA的组成部分,它可以将外源蛋白稳定地锚定在菌体表面,促进其在胞外发挥作用。本实验选用植物乳杆菌作为外源蛋白的递呈载体,将pgs A表面展示元件与猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)主要保护性抗原NS1基因进行融合构建新功能型乳酸菌,并对其免疫效果进行评价和分析。本实验的研究内容及结果如下:(1)新功能型乳酸菌p SIP409-pgs A-NS1的构建及蛋白表达通过基因工程方法构建重组质粒p SIP409-pgs A-NS1,并电转入植物乳杆菌中。重组菌经诱导肽诱导表达后,通过SDS-PAGE、BCA、Western blotting检测表达蛋白的大小、浓度和免疫反应原性。通过FCM和IF检测植物乳杆菌菌体表面的荧光强度来判定NS1蛋白的锚定和表达情况。实验结果表明:成功构建了新功能型乳酸菌p SIP409-pgs A-NS1,SDS-PAGE验证表达蛋白大小符合预期,BCA测定蛋白浓度为0.11146 mg/m L,Western blotting验证表达蛋白的免疫反应原性良好,FCM和IF在菌体表面检测出较强的荧光信号,表明pgs A成功地将NS1蛋白锚定在菌体表面。为下一步新功能型乳酸菌免疫动物以及攻毒实验奠定基础。(2)新功能型乳酸菌p SIP409-pgs A-NS1免疫保护效果的检测按免疫程序将新功能型乳酸菌喂饲小鼠。免疫结束后,通过MTS法检测小鼠脾脏淋巴细胞的增殖情况。ELISA方法检测小鼠体内NS1特异性Ig G和SIg A的含量。流式细胞术检测各免疫器官中T淋巴细胞和B淋巴细胞的活化情况。攻毒后监控小鼠体重,计算体重丢失率及存活率。制作小鼠肺部病理切片,计算肺指数和肺指数抑制率。ELISA方法检测攻毒前后小鼠血清中细胞因子的分泌情况。实验结果显示:新功能型乳酸菌可以有效刺激脾脏淋巴细胞增殖,提高小鼠体内NS1特异性Ig G和SIg A的水平,促进小鼠各免疫器官中T淋巴细胞和B淋巴细胞活化。攻毒后新功能型乳酸菌组小鼠体重丢失少且恢复快,存活率也明显高于其它对照组。肺指数、肺指数抑制率以及肺部病理切片表明:新功能型乳酸菌能缓解攻毒后小鼠肺部的炎性病变,降低肺部的病理损伤,可在一定程度上预防猪流感病毒的感染。综上所述,p SIP409-pgs A-NS1新功能型乳酸菌构建表达成功。pgs A可作为一种锚定基因可以将NS1蛋白稳定地锚定在植物乳杆菌菌体表面,促进其在胞外发挥作用。该菌还可刺激小鼠脾脏淋巴细胞的增殖,以及NS1特异性Ig G和SIg A抗体的分泌,增强B淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的活化,提高机体的体液免疫和细胞免疫水平,增强机体免疫力,为抗猪流感口服微生态制剂的研制提供了依据。
【关键词】：猪流感病毒 新功能型乳酸菌 NS1 pgsA
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S859.79
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10-11
• 第一篇 文献综述11-18
• 第一章 猪流感的研究进展11-13
• 1.1 猪流感的流行现状11
• 1.2 猪流感疫苗的研究进展11-13
• 第二章 流感病毒非结构蛋白NS1的研究进展13-16
• 2.1 NS基因及其编码蛋白13
• 2.2 NS1蛋白的结构13
• 2.3 甲型流感病毒非结构蛋白NS1的功能13-16
• 第三章 乳酸菌表面展示元件研究进展16-17
• 3.1 微生物表面展示技术概述16
• 3.2 pgsA蛋白的研究进展16-17
• 第四章 植物乳杆菌应用研究进展17-18
• 4.1 植物乳杆菌概述17
• 4.2 植物乳杆菌应用的研究进展17-18
• 第二篇 研究内容18-54
• 第一章 pSIP409-pgsA-NS1新功能型乳酸菌的构建及表达18-36
• 1 材料18-19
• 2 方法19-24
• 3 结果24-34
• 4 讨论34
• 5 小结34-36
• 第二章 pSIP409-pgsA-NS1新功能型乳酸菌免疫保护效果的研究36-54
• 1 材料36
• 2 方法36-38
• 3 结果38-52
• 4 讨论52-53
• 5 小结53-54
• 结论54-55
• 参考文献55-61
• 附录61-69
• 缩略语表（Abbreviation）69-70
• 作者简介70-71
• 致谢71

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