利用转基因小鼠模型研究FHL3基因对不同肌纤维类型形成的影响

发布时间：2017-06-10 14:09

  本文关键词：利用转基因小鼠模型研究FHL3基因对不同肌纤维类型形成的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肌肉是由不同类型的肌纤维构成,根据肌球蛋白重链的不同可将肌纤维类型分为I型、IIa型、IIb型和IIx型等四种。四种不同肌纤维在肌肉中所占比例的变化影响着肌肉的品质,因此研究不同肌纤维类型之间的转化对改良肌肉的品质具有重要意义。FHL3蛋白是LIM蛋白家族一员,本课题组前期研究表明在C2C12成肌细胞中超表达FHL3基因可抑制MyHC I基因的表达,促进MyHC IIa和MyHC IIb基因的表达,但在活体水平FHL3基因对不同肌纤维类型的影响仍不清楚。本研究以肌肉超表达FHL3转基因小鼠为模型,在活体水平上验证了该基因对不同肌纤维类型形成的影响。具体研究结果如下:1.构建了pEGFP-N1L-MCK-FHL3肌肉特异表达的转基因载体,利用PCR技术成功筛选获得FHL3阳性转基因小鼠,采用Q-PCR法和热不对称交错式PCR法检测了F0、F1代阳性小鼠外源FHL3基因拷贝数及F0代51号小鼠FHL3基因的插入位点,结果表明外源基因FHL3是以连续多个拷贝的方式插入小鼠基因组内,且51号个体FHL3基因插入在小鼠4号染色体内。2.统计了F0代小鼠窝产仔数、F1代小鼠阳性率以及生长曲线,结果表明F0代转基因母鼠的窝产仔数显著高于野生母鼠,F0代转基因公鼠所产后代阳性率显著低于F0代转基因母鼠所产后代的阳性率,2-8周龄转FHL3基因公鼠和母鼠的体重与野生公鼠和母鼠的体重无显著差异。3.利用Q-PCR方法检测了FHL3基因在2月龄转基因小鼠和野生小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠、胃、脂肪、肌肉、睾丸等组织中的表达量,结果表明转FHL3基因小鼠的心肌、骨骼肌、睾丸中,FHL3基因的mRNA表达量显著高于野生鼠。4.对2月龄小鼠股四头肌进行石蜡包埋、切片、HE染色,利用Image J软件对股四头肌肌纤维数目和横截面积分别进行统计,统计结果显示转FHL3基因小鼠的肌纤维数目和横截面积与野生鼠相比均无显著差异。5.提取2月龄转FHL3基因小鼠和野生小鼠腓肠肌组织的RNA和蛋白,利用Q-PCR和Western blotting技术分别检测了FHL3、MyHC I、MyHC IIa、MyHC IIb等基因的mRNA和蛋白的表达水平,结果表明转基因小鼠中FHL3、MyHC IIa、MyHC IIb基因的mRNA和蛋白表达量显著高于野生鼠,MyHC I基因的mRNA和蛋白表达量显著低于野生鼠。6.利用ATP酶染色和SDH染色区分2月龄小鼠比目鱼肌和股四头肌中的不同肌纤维类型,与非转基因小鼠相比,转基因小鼠I型纤维显著降低,II型纤维显著上升。综上所述,本研究利用转FHL3基因小鼠模型,验证了FHL3可负调控MyHC I基因的表达,正调控My HC IIa和MyHC IIb基因的表达,从而导致I型肌纤维降低,II型肌纤维增多。本研究在活体水平上阐明了FHL3基因对不同肌纤维类型的影响,为改善动物肉质品质提供了一定的理论基础。
【关键词】：FHL3 转基因小鼠 肌纤维类型 MyHC
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.2
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 缩略词表12-13
• 第一章 文献综述13-25
• 1 骨骼肌肌纤维的分类、特征及对肉质的影响13-16
• 1.1 骨骼肌肌纤维的分类13-14
• 1.2 骨骼肌肌纤维不同类型的特征14-15
• 1.3 骨骼肌不同肌纤维类型对肉质的影响15-16
• 2 调控肌纤维类型的信号通路16-19
• 2.1 胰岛素样生长因子（IGFS）信号通路17
• 2.2 钙调磷酸酶-活性T细胞核因子（CaN-NFAT）信号通路17-18
• 2.3 生肌调节因子（MRFS）途径18-19
• 3 FHL3家族的研究进展19-22
• 3.1 LIM蛋白的分类和功能19-20
• 3.2 FHL家族成员及特点20-21
• 3.3 FHL3的功能及其调控机制21-22
• 4 转基因动物的研究进展及制备方法22-24
• 5 研究的目的和意义24-25
• 第二章 材料和方法25-47
• 1 试验材料25-30
• 1.1 试验样品25
• 1.2 主要仪器和设备25-27
• 1.3 主要试剂与试剂盒27-28
• 1.4 常用试剂及配制28-29
• 1.5 应用的生物信息学网站及分析软件29-30
• 1.6 所用载体30
• 2 试验方法30-47
• 2.1 细胞培养30-31
• 2.1.1 细胞的复苏30-31
• 2.1.2 C2C12细胞的增殖培养31
• 2.1.3 C2C12细胞的分化培养31
• 2.1.4 细胞的冻存31
• 2.2 FHL3转基因载体构建31-36
• 2.2.1 总RNA的提取和cDNA的制备31-33
• 2.2.2 小鼠FHL3 cDNA的克隆33-34
• 2.2.3 琼脂糖凝胶电泳和成像34
• 2.2.4 PCR产物的胶回收和克隆测序34-35
• 2.2.5 质粒提取35
• 2.2.6 pEGFP-N1L-MCK-FHL3转基因载体的酶切鉴定35-36
• 2.3 转基因小鼠的饲养36
• 2.4 鼠尾DNA提取36-37
• 2.5 Quantitative real-time PCR分析37-38
• 2.6 转基因小鼠绝对定量拷贝数检测38-39
• 2.7 转基因小鼠插入位点检测39-41
• 2.7.1 热不对称交错式PCR及引物序列39-40
• 2.7.2 琼脂糖凝胶电泳和成像40
• 2.7.3 PCR产物的胶回收和克隆测序40
• 2.7.4 外源基因插入位点验证40-41
• 2.7.5 琼脂糖凝胶电泳和成像41
• 2.8 Western blotting分析41-44
• 2.8.1 蛋白提取41-42
• 2.8.2 BCA蛋白浓度测定42
• 2.8.3 SDS-PAGE电泳42-43
• 2.8.4 转膜43
• 2.8.5 封闭43
• 2.8.6 免疫反应43
• 2.8.7 ECL化学发光检测43-44
• 2.9 转基因小鼠的形态学检测44-47
• 2.9.1 转基因小鼠组织样品的采取44
• 2.9.2 石蜡切片的制作44
• 2.9.3 HE染色44-45
• 2.9.4 骨骼肌冰冻切片及ATP酶染色45
• 2.9.5 琥珀酸脱氢酶染色45-47
• 第三章 研究结果与分析47-59
• 1. 构建肌肉特异表达FHL3基因的转基因载体47-48
• 2. 转FHL3基因小鼠传代以及PCR检测筛选48
• 3. 转FHL3基因小鼠遗传性能及体重的变化48-50
• 4. 转FHL3基因小鼠睾丸组织形态的变化50-51
• 5. 外源基因拷贝数检测51-52
• 6. 外源基因插入位点的研究52-54
• 7. 转FHL3基因小鼠的组织表达谱54
• 8. 转FHL3基因小鼠肌肉HE染色54-55
• 9. 转FHL3基因小鼠中不同肌纤维类型的变化55-58
• 10.转FHL3基因小鼠不同肌纤维类型的形态学鉴定58-59
• 第四章 讨论59-63
• 1. 转FHL3基因小鼠的拷贝数、插入位点研究59-60
• 2. 转FHL3基因小鼠繁殖性状的研究60-61
• 3. 转FHL3基因小鼠肌纤维数目和横截面积的变化61
• 4. 转FHL3基因小鼠中不同肌纤维类型的变化61-63
• 第五章 小结63-64
• 1. 主要研究结果63
• 2. 下一步工作计划63-64
• 参考文献64-79
• 在读期间发表的文章79-80
• 致谢80

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  本文关键词：利用转基因小鼠模型研究FHL3基因对不同肌纤维类型形成的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

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