犬瘟热病毒SH株的分离鉴定及其感染性克隆的构建

发布时间：2017-06-10 14:07

  本文关键词：犬瘟热病毒SH株的分离鉴定及其感染性克隆的构建，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:犬瘟热(Canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)感染引起的犬科及其他食肉目动物等多种动物的急性、高度接触性传染病。死亡率高达80%,对当前的养犬业、毛皮动物养殖业及野生动物保护业产生了严重的危害。目前,我国CDV野生型毒株的反向遗传技术平台还不完善,限制着CDV在宿主动物体内扩散分布及其分子致病机制的研究。因此,构建CDV的感染性克隆以研究当前流行犬瘟热野毒株的特性具有重要的意义。方法:(1)将自然感染的患病犬病料按照1:10比例研磨,过滤后接种稳定表达犬SLAM受体的BHK-SLAM细胞,于感染后48-60h收集细胞毒继续传代,传至第三代时对收集的细胞提取RNA,以RT-PCR方法检测病毒,同时测定病毒滴度。最终大量扩增病毒,以差速离心法纯化,使用电子显微镜鉴定病毒;(2)采用RT-PCR技术从自然感染的患病犬病料中克隆出CDV全基因组序列及其H基因序列,利用生物信息学技术对全基因组序列进行拼接并分析,扩增的H基因命名为CDV-H,拼接的全基因组序列命名为CDV-SH株;(3)采用PCR方法扩增CDV N基因,扩增正确的片段克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导,表达重组N蛋白,并采用包涵体纯化的方法纯化重组蛋白。PCR扩增得到1572bp的N基因片段,用纯化的重组N蛋白免疫试验兔,制备N蛋白的多克隆抗体,用Western blot检测其特异性;(4)根据CDV的全基因组序列设计特异性引物,将CDV-SH株的全基因组分8个节段逐段插入PSK(+)载体,构建pSK-CDV-SH重组质粒;同时构建并分别表达CDV-SH株N、P、L基因的真核重组表达质粒pCI-CDV-N、pCI-CDV-P、pCI-CDV-L。采用脂质体转染的方法将上述4种质粒共转染BHK-SLAM细胞,培养72h后,收获细胞培养物,再盲传3代,用间接免疫荧光方法进行鉴定。结果:(1)分离了犬瘟热病毒,并测定其最高病毒滴度为10-4.8;(2)克隆并拼接了CDV-SH的全基因组序列,克隆了CDV-SH的H基因序列,二者序列分析结果均表明CDV-SH毒株属于亚洲1型;(3)表达了CDV N蛋白,并制备了特异性良好的多克隆抗体;(4)构建了CDV强毒株CDV-SH的感染性克隆。结论:分离并鉴定了CDV强毒株SH毒株;制备了CDV N蛋白的特异性多克隆抗体;成功构建了CDV-SH株的感染性克隆,为研究我国CDV的致病机理和遗传变异等提供了良好技术平台。
【关键词】：犬瘟热 N基因 原核表达 全基因组 感染性克隆
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 犬瘟热病毒的研究进展12-20
• 1.1 前言12
• 1.2 犬瘟热历史12-13
• 1.3 犬瘟热病毒的流行病学和发病机理13-14
• 1.4 病毒的入侵和释放14
• 1.5 核糖核蛋白复合体RNP的形成14-15
• 1.6 病毒粒子的转录15-16
• 1.7 基因组的复制16
• 1.8 麻疹病毒属病毒基因组16-18
• 1.8.1 核衣壳蛋白N16-17
• 1.8.2 磷蛋白P17
• 1.8.3 半胱氨酸蛋白V及C蛋白开放阅读框17
• 1.8.4 基质蛋白M17
• 1.8.5 融合蛋白F17-18
• 1.8.6 血凝素蛋白H18
• 1.8.7 大蛋白L18
• 1.9 犬瘟热感染性克隆的研究18-20
• 第二章 犬瘟热病毒的分离鉴定20-27
• 2.1 材料20
• 2.1.1 主要试剂20
• 2.1.2 病料与细胞20
• 2.2 方法20-23
• 2.2.1 病料处理20
• 2.2.2 细胞培养20-21
• 2.2.3 病毒的分离培养21
• 2.2.4 病毒的鉴定21-23
• 2.3 结果23-26
• 2.3.1 试纸条快速检测结果23
• 2.3.2 病毒分离结果23-24
• 2.3.3 RT-PCR鉴定结果24
• 2.3.4 病毒形态观察24-25
• 2.3.5 病毒TCID50的测定25-26
• 2.4 讨论26
• 2.5 结论26-27
• 第三章 犬瘟热病毒全基因组序列及H基因的序列分析27-39
• 3.1 材料27
• 3.2 方法27-30
• 3.2.1 引物设计合成27-29
• 3.2.2 RNA抽提及RT-PCR扩增29
• 3.2.3 目的基因的克隆和测序29
• 3.2.4 序列拼接29
• 3.2.5 序列结果分析29-30
• 3.3 结果30-37
• 3.3.1 不同基因组片段RT-PCR扩增结果30-31
• 3.3.2 H基因克隆初步鉴定结果31
• 3.3.3 基因测序结果分析31-34
• 3.3.4 基因遗传进化分析34-37
• 3.3.5 H基因的序列糖基化位点分析37
• 3.4 讨论37-38
• 3.5 小结38-39
• 第四章 犬瘟热病毒SH株N基因原核表达及多克隆抗体制备39-46
• 4.1 材料39
• 4.1.1 菌株与质粒39
• 4.1.2 主要试剂39
• 4.2 方法39-41
• 4.2.1 CDV N基因的扩增39-40
• 4.2.2 重组表达质粒的构建与鉴定40
• 4.2.3 CDV N基因的诱导表达40
• 4.2.4 CDV N融合蛋白的纯化与定量40-41
• 4.2.5 兔抗CDV N多克隆抗体的制备41
• 4.2.6 Western blot检测多克隆抗体特异性41
• 4.2.7 间接免疫荧光试验（IFA）41
• 4.3 结果41-44
• 4.3.1 目的基因的扩增重组表达质粒的鉴定41-42
• 4.3.2 CDV N蛋白表达42-43
• 4.3.3 表达产物的纯化与定量43
• 4.3.4 间接免疫荧光试验（IFA）43-44
• 4.3.5 重组蛋白pET-32a-N多抗的鉴定44
• 4.4 讨论44-45
• 4.5 小结45-46
• 第五章 犬瘟热病毒CDV-SH株感染性克隆的构建46-51
• 5.1 材料46-47
• 5.1.1 病毒株、细胞与质粒46
• 5.1.2 主要试剂46-47
• 5.2 方法47-48
• 5.2.1 引物合成与设计47
• 5.2.2 CDV-SH感染性克隆及辅助质粒的构建47-48
• 5.2.3 CDV-SH野毒株全长cDNA感染性克隆初步鉴定48
• 5.3 结果48-49
• 5.3.1 CDV-SH野毒株全长cDNA感染性克隆及辅助质粒的构建48-49
• 5.3.2 间接免疫荧光检测49
• 5.4 讨论49-50
• 5.5 结论50-51
• 结论51-52
• 参考文献52-58
• 英文缩略表58-59
• 致谢59-60
• 作者简介60

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