鸡NK细胞C-型凝集素样受体蛋白BNK19的单抗制备

发布时间：2017-06-11 13:01

  本文关键词：鸡NK细胞C-型凝集素样受体蛋白BNK19的单抗制备，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：自然杀伤(Natural killer,NK)细胞是哺乳动物以及其他脊椎动物天然免疫系统的重要组成部分,具有抗肿瘤、抗病毒感染的作用。NK细胞发挥杀伤功能与活化性受体与抑制性受体介导的信号传递有关。近年来,鸡NK细胞的研究也逐渐受到重视,研究的主要困难在于缺乏确定的NK细胞表面标志。b-nk基因编码的BNK蛋白是表达于鸡NK细胞表面的C型凝集素样受体蛋白。BNK是高度糖基化的Ⅱ型跨膜蛋白,胞质尾区有一个免疫受体酪氨酸抑制基序,与哺乳动物NK细胞受体结构相似,因此推测BNK蛋白是鸡NK细胞的潜在受体。b-nk基因位于鸡的主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)核心区域,与MHC-B核心基因紧密连锁。本研究利用国家禽类实验动物种子中心保存的MHC单倍型鸡BW/G1等6个品系,包括B19、B21等MHC-B单倍型,根据NCBI上公布的不同单倍型鸡的b-nk基因序列,比较了单倍型鸡的b-nk基因多态性,生物信息学分析结果与标准单倍型序列完全一致,表明可以利用b-nk基因进行MHC单倍型鸡遗传稳定性监测,同时也为后续实验提供了实验材料。以对多种疫病有较强敏感性的B19单倍型鸡b-nk基因原核表达蛋白(BNK19)免疫小鼠,建立间接ELISA方法,筛选获得一株单克隆抗体杂交瘤细胞株7A10,与原核表达的BNK21没有Western Blot反应性,具有鉴别意义。截短表达分析结果表明,7A10针对表位在E149-S168之间。从B19单倍型鸡外周血中分离淋巴细胞,刀豆素-A刺激后,提取细胞总RNA,RT-PCR方法扩增b-nk19基因,插入真核表达载体pIRES,成功构建真核表达载体pIRES-BNK19,转染CHO细胞系,用G418加压筛选获得稳定表达BNK19的细胞系。7A10单抗能够通过Western Blot检测到鸡外周血淋巴细胞中BNK蛋白的表达。利用流式细胞仪检测,7A10标记细胞占鸡外周血淋巴细胞的16.7%。本实验为BNK蛋白在鸡NK细胞中的分子机制研究提供了基础。
【关键词】：BNK蛋白 自然杀伤细胞 单克隆抗体
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S831
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 英文缩略表11-12
• 第一章 引言12-19
• 1.1 研究的目的和意义12-15
• 1.1.1 NK细胞的功能12-13
• 1.1.2 NK细胞受体的位置及分类13-14
• 1.1.3 NK细胞受体结构与功能14-15
• 1.2 鸡NK细胞15-19
• 1.2.1 鸡NK细胞的鉴定15-16
• 1.2.2 鸡NK细胞受体基因16-17
• 1.2.3 鸡NK细胞受体17-19
• 第二章 MHC单倍型BW/Gn鸡群的b-nk基因序列分析19-23
• 2.1 材料19
• 2.1.1 实验动物19
• 2.1.2 主要试剂19
• 2.1.3 主要仪器19
• 2.2 方法19-20
• 2.2.1 b-nk基因序列分析19
• 2.2.2 序列分析19-20
• 2.3 结果20-21
• 2.3.1 b-nk基因测序结果20
• 2.3.2 b-nk氨基酸序列分析20-21
• 2.4 讨论21-23
• 第三章 B19单倍型鸡BNK单克隆抗体的制备23-30
• 3.1 材料23
• 3.1.1 实验动物23
• 3.1.2 主要试剂23
• 3.1.3 主要仪器23
• 3.2 方法23-27
• 3.2.1 BNK19蛋白的纯化23-24
• 3.2.2 动物免疫24
• 3.2.3 间接ELISA方法的建立24
• 3.2.4 细胞融合24-25
• 3.2.5 间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞25
• 3.2.6 杂交瘤细胞的亚克隆、冻存和复苏25-26
• 3.2.7 杂交瘤细胞腹水的制备及纯化26
• 3.2.8 单克隆抗体的亚型鉴定及腹水效价26
• 3.2.9 单克隆抗体腹水的Western Blot检测26
• 3.2.10 单抗表位的鉴定26-27
• 3.3 结果27-29
• 3.3.1 BNK19原核表达蛋白纯化结果27-28
• 3.3.2 间接ELISA方法的建立28
• 3.3.3 单抗亚型鉴定及腹水效价测定28
• 3.3.4 腹水的Western blot检测28
• 3.3.5 7A10单抗表位的初步鉴定28-29
• 3.4 讨论29-30
• 第四章 稳定表达B19单倍型鸡BNK蛋白的细胞系构建30-36
• 4.1 材料30
• 4.1.1 生物材料30
• 4.1.2 主要试剂30
• 4.1.3 主要仪器30
• 4.2 方法30-32
• 4.2.1 b-nk19基因的引物设计30
• 4.2.2 b-nk19基因mRNA的提取及扩增30-31
• 4.2.3 pIRES-BNK19真核表达载体的构建31
• 4.2.4 pIRES-BNK19真核表达细胞系的建立31-32
• 4.2.5 BNK19蛋白表达细胞系的RT-PCR鉴定32
• 4.2.6 BNK19蛋白表达细胞系的IFA鉴定32
• 4.2.7 BNK19蛋白表达细胞系的Western Bolt鉴定32
• 4.2.8 CHO-BNK19稳定表达细胞系的建立32
• 4.3 结果32-35
• 4.3.1 pIRES-BNK19重组质粒的构建32-33
• 4.3.2 表达BNK19蛋白瞬时细胞系的建立33
• 4.3.3 细胞系的RT-PCR鉴定33-34
• 4.3.4 IFA鉴定34
• 4.3.5 Western Bolt鉴定34-35
• 4.3.6 CHO-BNK19稳定表达细胞系的建立35
• 4.4 讨论35-36
• 第五章 鸡不同组织淋巴细胞中BNK蛋白的表达36-40
• 5.1 材料36
• 5.1.1 生物材料36
• 5.1.2 主要试剂36
• 5.1.3 主要仪器36
• 5.2 方法36-37
• 5.2.1 BNK蛋白在鸡胚脾脏淋巴细胞的表达36-37
• 5.2.2 BNK蛋白在外周血淋巴细胞的表达37
• 5.3 结果37-38
• 5.3.1 BNK蛋白在鸡胚脾脏淋巴细胞中表达37-38
• 5.3.2 BNK蛋白在外周血淋巴细胞中表达38
• 5.4 讨论38-40
• 第六章 全文结论40-41
• 参考文献41-48
• 致谢48-49
• 作者简历49

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