猪源趋化因子CXCL17的基因克隆与刺激表达研究

发布时间：2017-06-11 15:09

  本文关键词：猪源趋化因子CXCL17的基因克隆与刺激表达研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：CXC趋化因子家族配基17(CXC Ligand 17,CXCL17)是一个新发现的趋化因子,仅有10年历史,目前主要关于人源和鼠源CXCL17的研究,猪源CXCL17相关研究尚未见报道。已有人源和鼠源CXCL17研究报道,它是一个多功能蛋白质,具有潜在的杀菌活性,抗炎活性,促进血管生成及抗凋亡活性。这些活性研究主要集中于单核-巨噬细胞及各种肿瘤细胞等,未涉及到肠道细胞。肠道的健康水平很大程度的影响了猪的养殖,猪源CXCL17基因的克隆及其在猪肠道中的表达研究,不仅为人们对CXCL17带来更全面的认识,也将会为一些猪肠道疾病的研究带来更新的了解,甚至给出更好的治疗解决方案。本研究以人CXCL17基因核苷酸序列为模板,从猪的EST库中筛选出一系列相似序列,利用软件拼接后,预测到猪CXCL17基因序列,以猪肺组织总RNA经RT-PCR扩增后的c DNA为模板再次扩增,得到了猪CXCL17基因序列。对所得猪CXCL17核苷酸序列及氨基酸序列进行生物信息学分析,预测猪CXCL17是一个亲水性小分子碱蛋白。另外,通过信号肽分析,预测其也是一个分泌性蛋白。此外,同源性及进化树分析结果显示它与人CXCL17具有较高的相似度及亲缘性,因此,猪CXCL17在功能上应与人CXCL17极为接近。同时做组织分布研究,确定了猪CXCL17的结构特性和分布特点,发现它在肺,胃部以及小肠中的分泌居多。接着构建了猪CXCL17的原核表达载体p ET28a-sus CXCL17,以及真核表达载体pc DNA-sus CXCL17,用于后续对猪CXCL17蛋白结构和活性更深入的探索。另外本研究,对猪CXCL17在肠道细胞中的表达做了研究。用多种细菌感染IPEC-J2细胞,发现IPEC-J2细胞受大肠杆菌等革兰氏阴性菌刺激时CXCL17的表达水平增高显著,初步证实肠道受到革兰氏阴性菌的感染时高表达CXCL17,进而发挥着抗菌作用,此外推测革兰氏阴性菌区别于革兰氏阳性菌的特有成分——脂多糖对于CXCL17的诱导发挥着主要作用。接着提取了大肠杆菌的脂多糖成分,以不同剂量分别作用于IPEC-J2细胞,发现脂多糖作用时,CXCL17的表达升高,而且与脂多糖存在剂量依赖关系。以上实验证明脂多糖能够激活肠道细胞中CXCL17的高表达,推测CXCL17在猪肠道中对于革兰氏阴性菌的感染以及脂多糖引起的肠道炎症中发挥抗菌及抗炎作用。
【关键词】：猪 CXCL17 载体构建 细菌感染
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828
【目录】：

• 摘要3-4
• abstract4-6
• 主要英文缩略词及符号6-11
• 1 前言11-20
• 1.1 趋化因子的概述11-12
• 1.2 新型趋化因子CXCL17概述12-16
• 1.2.1 人和小鼠CXCL17的发现12-13
• 1.2.2 CXCL17的特性13-14
• 1.2.3 CXCL17受体的发现14
• 1.2.4 CXCL17功能作用14-15
• 1.2.5 猪源CXCL17的研究现状及意义15-16
• 1.3 IPEC-J2细胞概述16-17
• 1.4 本研究的目的意义与技术路线17-20
• 2 材料与方法20-37
• 2.1 实验材料20-24
• 2.1.1 质粒20
• 2.1.2 菌株20
• 2.1.3 细胞20
• 2.1.4 实验动物组织20
• 2.1.5 引物20-21
• 2.1.6 主要试剂与配方21-23
• 2.1.7 主要仪器设备23-24
• 2.2 实验方法24-37
• 2.2.1 感受态细胞的制备24
• 2.2.2 质粒的抽提24-25
• 2.2.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)25-26
• 2.2.4 Trizol法提取总RNA26-27
• 2.2.5 c DNA第一链的合成27
• 2.2.6 基因的克隆与生物信息学分析27-31
• 2.2.7 原核表达载体构建31-32
• 2.2.8 真核表达载体构建32-33
• 2.2.9 IPEC-J2细胞的培养33-34
• 2.2.10 转染34
• 2.2.11 细菌感染IPEC-J2细胞34-35
• 2.2.12 大肠杆菌脂多糖（LPS）提取35
• 2.2.13 实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测基因的表达35-37
• 3 结果与分析37-58
• 3.1 猪CXCL17基因的克隆37-40
• 3.1.1 RNA质量的检测37
• 3.1.2 引物的设计与合成37-38
• 3.1.3 猪CXCL17基因的扩增38-39
• 3.1.4 猪CXCL17基因T载体构建39-40
• 3.2 生物信息学分析40-48
• 3.2.1 猪CXCL17基因开放阅读框(ORF)寻找及组成分析40-41
• 3.2.2 猪CXCL17蛋白理化性质分析41-42
• 3.2.3 猪CXCL17蛋白的亲水性、疏水性分析42-43
• 3.2.4 猪CXCL17信号肽序列预测分析43-44
• 3.2.5 猪CXCL17蛋白磷酸化位点预测分析44-45
• 3.2.6 猪CXCL17二级结构预测分析45-46
• 3.2.7 猪CXCL17蛋白质氨基酸序列同源性分析46
• 3.2.8 猪CXCL17氨基酸序列进化树构建与分析46-48
• 3.3 实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测猪CXCL17表达方法的构建48-50
• 3.3.1 RT-q PCR的引物特异性鉴定48-49
• 3.3.2 标准曲线的建立49-50
• 3.4 猪CXCL17的组织分布50-51
• 3.5 猪CXCL17的原核表达51-53
• 3.5.1 带酶切位点引物的设计与合成51
• 3.5.2 猪CXCL17成熟肽基因的扩增51-52
• 3.5.3 重组原核表达质粒鉴定52-53
• 3.5.4 重组原核表达载体的诱导表达53
• 3.6 猪CXCL17真核表达53-55
• 3.6.1 带酶切位点引物的设计与合成53
• 3.6.2 猪CXCL17全长肽基因的扩增53-54
• 3.6.3 重组真核表达质粒鉴定54
• 3.6.4 重组真核表达质粒转染IPEC-J2细胞CXCL17的表达54-55
• 3.7 不同细菌感染IPCE-J2细胞后CXCL17的表达55-56
• 3.8 不同剂量LPS作用IPEC-J2细胞后CXCL17的表达56-58
• 4 讨论与结论58-61
• 4.1 讨论58-60
• 4.2 结论60-61
• 致谢61-62
• 参考文献62-66

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 张永刚;R.Davin;;猪小肠上皮细胞作用的新发现[J];中国畜牧杂志;2015年08期

2 李美玲;;猪肠道疾病在生产中的防制措施[J];畜禽业;2012年05期

3 彭佳师;龚继明;;信号肽与蛋白质的分选转运[J];植物生理学报;2011年01期

4 Melania C;张锦秀;;猪肠道感染鼠伤寒沙门氏菌免疫应答的定量分析[J];中国畜牧兽医;2011年01期

5 严丹红;郝葆青;吴润;农向;;致病性大肠埃希菌毒力因子致病性及研究进展[J];西南民族大学学报(自然科学版);2005年S1期

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本文编号：441873