miR-324-3p对羊驼黑素刺激素受体1基因功能的影响

发布时间：2017-06-12 04:05

  本文关键词：miR-324-3p对羊驼黑素刺激素受体1基因功能的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：黑素皮质素受体1 (melanocortin-1 receptor, MC1R)定位于成熟黑色素细胞表面,该基因被视为动物黑色素合成及类型转变相关基因的主效基因之一。经预测筛选,miR-324-3p能靶向调控MC1R基因的表达。为了研究niR-324-3p对羊驼MC1R基因功能的影响,本试验通过双荧光素酶报告载体验证miR-324-3p与靶基因间的靶向关系,向体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞内转染miR-324-3p过表达载体,应用实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹方法对MCIR及其下游调控的毛色相关基因在mRNA及蛋白水平的表达量进行分析,并采用酶标仪测定黑色素产量。试验方法及主要研究结果如下：1 应用qRT-PCR分析miR-324-3p在白色与棕色羊驼皮肤黑色素细胞中的表达差异性。结果显示,miR-324-3p在棕色羊驼皮肤黑色素细胞中的表达量极显著高于在白色的表达量(P0.01),且在棕色羊驼皮肤黑色素细胞中的相对表达量是白色羊驼的1.64倍。2应用双荧光素酶报告基因试验验证miR-324-3p与MC1R基因间的靶向关系。将体外培养的293T细胞分为3个组,分别为A组(只转染pmirGLO-MC 1 R-3'UTR载体)、B组(同时转染miR-NC与pmirGLO-MC1R-3'UTR载体)、C组(同时转染pmirGLO-MC1R-3'UTR与miR-324-3p过表达载体)。结果显示,含miR-324-3p过表达载体组的荧光素酶活性是对照组的0.69倍。3 应用qRT-PCR测定MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2基因在转录水平的表达量。将体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞分为3个组,分别为试验处理组(miR组,转染miR-324-3p过表达载体)、Negtive Control组(NC组，只转染miR-NC空载体)、空白组(KB组，，不做载体转染)。结果显示,(1)miR组MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2基因在转录水平的表达量分别是NC组的0.194、0.473、0.550及0.920倍，其中MC1R、Mitf及Tyr的表达量较NC组均差异极显著(P0.01), Tyrp2的表达量较NC组差异显著(P0.05)；(2)miR组MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2基因在转录水平的表达量分别是KB组的0.019、0.321、0.180及0.347倍,miR组中MC1R、Mitf、Tyr和Tyrp2的表达量较KB组均差异极显著(P0.01)。4应用Western blotting测定各试验组中MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2基因在蛋白水平的表达量。结果显示,miR组MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2基因在蛋白水平的表达量分别是NC组的0.815、0.389、0.903、0.808倍,是KB组的0.811、0.382、0.889、0.733倍；miR组中的4个基因在蛋白水平的表达量较NC与KB组均差异极显著(P0.01)。5应用酶标仪分别测定3组黑色素细胞中黑色素的A475吸光值,用各处理组黑色素的A475吸光值占空白组的比值表示各组黑色素的相对产量。结果显示,miR组黑色素相对产量是0.498739±0.0112840,NC组黑色素相对产量是0.878930士0.0202527,KB组黑色素相对产量为1.000000±0.0342576,miR组黑色素相对产量较NC与KB组均差异极显著(P0.01)。上述结果证实羊驼皮肤黑色素细胞中表达的miR-324-3p可靶向调控MC1R基因的表达,进而影响MC1R下游调控的黑色素形成相关基因的表达,影响黑色素的细胞合成,为研究]miR-324-3p与MC1R基因与羊驼毛色形成机制提供理论依据。
【关键词】：羊驼 miR-324-3p MC1R qRT-PCR 黑色素
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S829.9
【目录】：

• 摘要8-10
• 前言10-11
• 文献综述11-20
• 1 miRNA的生物合成及其功能11-14
• 1.1 miRNA的细胞合成11-12
• 1.2 miRNA与黑色素形成相关研究12-13
• 1.3 miR-324-3p的研究进展13-14
• 2 黑色素合成的相关基因14-17
• 2.1 MC1R基因14-15
• 2.2 Mitf基因15-16
• 2.3 酪氨酸酶基因家族基因(Tyr、Tyrp1、Tyrp2)16-17
• 3 黑色素的细胞合成及检测17-19
• 3.1 黑色素的细胞合成17-18
• 3.2 体外黑色素含量的检测18-19
• 4 本研究的研究目的意义19-20
• 材料和方法20-34
• 1 试验材料20-23
• 1.1 试验样本20
• 1.2 试验所用仪器设备20
• 1.3 细胞培养所需主要试剂及耗材20-21
• 1.4 载体构建所需主要试剂及耗材21
• 1.5 双荧光素酶报告基因检测系统靶基因验证所需试剂21-22
• 1.6 过表达载体转染细胞所需试剂耗材22
• 1.7 总RNA提取、反转录PCR、qRT-PCR所需试剂及耗材22
• 1.8 蛋白免疫印迹所需试剂及耗材22-23
• 1.9 黑色素含量测定所需试剂及耗材23
• 2 试验方法23-34
• 2.1 羊驼皮肤黑色素细胞的培养23-24
• 2.1.1 细胞复苏23-24
• 2.1.2 细胞传代24
• 2.1.3 细胞冻存24
• 2.2 羊驼皮肤黑色素细胞总RNA的提取24
• 2.3 内源性miRNA-324-3p的PCR扩增及表达差异性验证24-26
• 2.3.1 总RNA反转录PCR24-25
• 2.3.2 内源性miRNA-324-3p的PCR扩增25-26
• 2.3.3 miR-324-3p在不同毛色羊驼皮肤中的表达差异性26
• 2.4 miR-324-3p过表达载体转染羊驼皮肤黑色素细胞26-27
• 2.5 双荧光素酶报告基因靶基因验证27-29
• 2.5.1 pMD18T-MC1R-3'UTR Plasmid构建27-28
• 2.5.2 pmirGLO-MC1R-3'UTR Plasmid构建28-29
• 2.6 qRT-PCR检测不同试验组中MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2的表达差异性29-30
• 2.7 Weatern Blotting30-32
• 2.7.1 黑色素细胞总蛋白提取30-31
• 2.7.2 各目的蛋白及内参蛋白Western Blotting31-32
• 2.8 黑色素提取及含量测定32-34
• 试验结果34-46
• 3.1 羊驼miR-324-3p及其靶基因的预测34
• 3.1.1 羊驼miR-324-3p成熟体34
• 3.1.2 羊驼miR-324-3p靶基因的预测34
• 3.2 羊驼皮肤黑色素细胞总RNA的提取34-35
• 3.3 内源性miRNA-324-3p的PCR扩增及表达差异性检测35-37
• 3.3.1 不同毛色羊驼黑色素细胞中miRNA-324-3p的扩增35-36
• 3.3.2 miR-324-3p在不同毛色羊驼黑色素细胞中的表达差异性36
• 3.3.3 转染过表达载体后羊驼黑色素细胞中miR-324-3p的表达差异性36-37
• 3.4 构建的pmirGLO-MC1R-3'UTR载体图谱及其测序结果37-38
• 3.4.1 pmirGLO-MC1R-3'UTR载体测序结果37
• 3.4.2 pPG/miR/eGFP/Blasticidin-miR-324-3p测序结果及其载体图谱37-38
• 3.5 双荧光素酶报告基因靶基因验证38-39
• 3.6 qRT-PCR分析MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2基因的表达39-42
• 3.6.1 表达载体转染羊驼皮肤黑色素细胞效率鉴定39-40
• 3.6.2 MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2基因qRT-PCR扩增曲线40-41
• 3.6.3 miR-324-3p对MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2基因表达的影响41-42
• 3.7 蛋白免疫印迹分析MC1R、Mitf、Tyr及Tyrp2蛋白水平表达差异42-45
• 3.7.1 羊驼皮肤黑色素细胞总蛋白条带42-43
• 3.7.2 miR-324-3p对试验组中各目的基因在蛋白水平表达差异性的影响43-45
• 3.8 miR-324-3p对黑色素产量的影响45-46
• 讨论46-49
• 4.1 miR-324-3p与黑色素合成46-47
• 4.2 miR-324-3p对MC1R基因的影响47-49
• 4.3 展望49
• 结论49-50
• 参考文献50-56
• Abstract56-58
• 致谢58

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