不同插入位点表达H5亚型AIV HA基因重组鸡痘病毒的构建及免疫效力的比较研究

发布时间：2017-06-12 07:00

  本文关键词：不同插入位点表达H5亚型AIV HA基因重组鸡痘病毒的构建及免疫效力的比较研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：H5亚型禽流感(AI)给我国的养禽业造成了严重的经济损失,而疫苗免疫是防控该病的重要手段。血凝素(HA)是禽流感病毒(AIV)诱导宿主产生中和抗体最重要的保护性抗原,然而HA基因容易发生突变,导致近年来我国H5亚型AIV出现多个流行分支,因此开发免疫效果好的多价H5亚型禽流感疫苗对于有效防控该病具有重要意义。鸡痘病毒(FPV)具有多个复制非必需区,是构建表达H5亚型不同分支HA基因重组疫苗的理想载体。目前,虽然同一复制非必需区插入多个HA的重组鸡痘疫苗已有报道,但该型疫苗免疫效果的提高仍然有限。我们也可在不同复制非必需区插入不同的HA基因构建多价疫苗,而复制非必需区的筛选可能是影响重组鸡痘疫苗免疫效果的关键。因此,本研究构建了复制非必需区(FPV34)表达HA基因的重组鸡痘疫苗,并与其它插入位点(FPV12)的重组鸡痘病毒进行了生长特性、HA转录及蛋白表达水平以及免疫效力的比较研究,旨在为多价H5亚型禽流感重组鸡痘疫苗的研制奠定一定的基础。1表达H5亚型AIV HA基因重组鸡痘病毒的构建将PCR扩增的鸡痘病毒复制非必需区片段FPV3和FPV4克隆至pBluescript SK(-)载体,得到载体pSKP3P4;然后将从质粒pFG1175-1酶切下来的标记基因表达框P11-LacZ和从质粒P12LS酶切下来的启动子Ps分别克隆至载体pSKP3P4,得到转移载体p34xLs;最后将H5亚型AIVSY株(clade 2.3.4)和W6-7株(clade 7.2)的HA基因分别插入转移载体p34xLS中Ps启动子下游,获得转移载体p34xLs-SYHA和p34xLs-W6-7HA。用脂质体法转染已感染FPV的CEF,利用蓝白斑筛选获得纯化的表达HA基因的重组鸡痘病毒rFPV34-SYHA和rFPV34-W6-7HA。提取重组病毒的基因组DNA,分别扩增HA基因,证明目的基因成功插入鸡痘病毒基因组；免疫荧光试验表明HA基因能够在重组鸡痘病毒中正确表达。2不同插入位点重组鸡痘病毒的生长特性、HA转录和蛋白表达水平的比较重组鸡痘病毒rFPV12-SYHA和rFPV34-SYHA分别感染鸡胚成纤维细胞(CEF),首先测定各病毒的效价及生长曲线。其次,运用相对荧光定量PCR的方法检测以上两株重组病毒HA基因在CEF细胞中的转录水平。最后,采用ELISA比较重组病毒外源基因的蛋白表达水平。生长曲线的结果表明两株重组病毒rFPV12-SYHA和rFPV34-SYHA在生长特性方面类似；相对荧光定量PCR的结果表明了它们在HA基因转录水平方面没有显著差异；ELISA数据则证明了rFPV12-SYHA和rFPV34-SYHA在表达HA蛋白方面没有显著差异。3表达H5亚型AIVHA基因重组鸡痘病毒免疫效力试验10日龄SPF鸡随机分组,分别免疫rFPV12-SYHA、rFPV34-SYHA、rFPV34-W6-7HA和wt-FPVLP,剂量为105PFU/只,同时设H5亚型AI油乳剂灭活苗对照组和PBS对照组,剂量为0.2 mL/只。在免疫后7d、10d、14d、17d和21d分别采集外周血,检测HI抗体效价。结果显示,各重组病毒均能够诱导产生一定水平的HI抗体,但均显著低于灭活油苗组(P0.05)。免疫后21 d,分别用相应的母本SY株和W6-7株进行攻毒,攻毒剂量均为105EID50,随后观察各疫苗对鸡的免疫保护效果,采集喉拭子和泄殖腔拭子并测定排毒情况。结果表明,针对AIVSY株攻击,rFPV12-SYHA和rFPV34-SYHA免疫组的攻毒保护率为85%,而免疫灭活油苗SY组的保护率为95%；针对AIV W6-7株攻击,rFPV34-W6-7HA免疫组的保护率为90%,灭活油苗W6-7免疫组的保护率同样为90%。综上所述,在不同复制非必需区(FPV12和FPV34)表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒,其生长特性、基因的转录水平、蛋白的表达水平和免疫保护效力类似；证明了这两个复制非必需区均可作为外源片段的插入区,这为研制H5 AIV多价疫苗奠定了基础。
【关键词】：H5亚型禽流感病毒 HA基因 鸡痘病毒 复制非必需区 免疫效力
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-9
• 符号说明9-10
• 综述10-26
• 参考文献19-26
• 第一章 表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒的构建26-45
• 1 材料26-27
• 2 方法27-38
• 3 结果38-42
• 4 讨论42-43
• 参考文献43-45
• 第二章 不同插入位点重组鸡痘病毒的生长特性、HA转录和蛋白表达水平的比较45-53
• 1 材料45-46
• 2 方法46-48
• 3 结果48-51
• 4 讨论51-52
• 参考文献52-53
• 第三章 表达H5亚型AIV HA基因重组鸡痘病毒的免疫效力试验53-61
• 1 材料53
• 2 方法53-54
• 3 结果54-58
• 4 讨论58-60
• 参考文献60-61
• 全文小结61-62
• 致谢62-63

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 彭芸芸;仲晓宁;李春蕾;;伪狂犬病毒载体的研究进展[J];山东畜牧兽医;2013年05期

2 金明兰;金宁一;鲁会军;马鸣潇;郑敏;;鸡痘病毒在哺乳细胞内复制的研究[J];中国兽医学报;2013年03期

3 贾立军,彭大新,张艳梅,刘红旗,刘秀梵,程坚 ,陈素娟 ,韦栋平 ,黄勇 ,张如宽;H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗的构建及其遗传稳定性与免疫效力[J];微生物学报;2003年06期

4 程坚,刘秀梵,彭大新,刘红旗;表达H9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力[J];微生物学报;2002年04期

5 肖履中;鸡痘病毒HQ98株超微结构观察[J];青海畜牧兽医杂志;2000年03期

  本文关键词：不同插入位点表达H5亚型AIV HA基因重组鸡痘病毒的构建及免疫效力的比较研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：443444