MBV、SRV、SIV血清抗体调查及间接ELISA检测方法的初步建立

发布时间：2017-06-12 13:05

  本文关键词：MBV、SRV、SIV血清抗体调查及间接ELISA检测方法的初步建立，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猴B病毒(Monkey B virus, MBV)是普通级实验猴的必须检测项目,要求阴性,可感染多种动物和人,人感染后的死亡率高达80%,幸存者有神经后遗症,而猴感染后仅表现轻微的疱疹症状或无症状,但长期带毒、间歇排毒,其潜伏感染的特性常造成假阴性检测结果。MBV只有一个血清型,抗原性稳定,其核苷酸序列和氨基酸序列己确定,囊膜糖蛋白gD被证实有较高的诊断潜能。猴D型逆转录病毒(Simian type D Retrovirus, SRV)、猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus, SIV)是SPF级实验猴的必需检测项目,要求阴性。SRV和SIV是猴艾滋病的病原,感染后都会引起免疫缺陷症状,但是SIV在其天然宿主不致病,只有跨种群感染才会导致猴艾滋病的发生。SRV有7个血清型,其中1～3己测序完成,核衣壳蛋白p27的氨基酸序列高度保守。SIV衣壳蛋白p27含有主要抗原决定簇,且具有群抗原性,被认为是SIV抗原检测的标志物。本实验主要从以下三方面开展：1.上海地区实验用猴MBV、SRV、SIV三种病毒的血清抗体调查共检测475份血清样本,MBV血清抗体阳性34份,阳性率7.158%；SRV血清抗体阳性20份,阳性率4.211%; SIV血清抗体阳性1份,阳性率0.2105%,阳性率与年份和样本总数没有相关性。2.目的蛋白的表达、纯化及鉴定将pET28a-gD (MBV)质粒转化到BL21(DE3)菌株,表达MBV gD蛋白,分子量约为48.24kD,经镍琼脂糖亲和层析纯化后,用Western blot证明该蛋白具有抗原性,测得蛋白浓度为3.726mg/mL。将pET28b-p27 (SRV)质粒转化到tosetta (DE3)菌株,表达SRV p27蛋白,分子量约为26.2kD,经镍琼脂糖亲和层析纯化后,用Western blot证明该蛋白具有抗原性,测定蛋白浓度为2.043mg/mL。将pET28a-p27 (SIV)质粒转化到Rosetta (DE3)菌株,表达SIV p27蛋白,分子量约为24.6kD,经镍琼脂糖亲和层析纯化后,用Western blot证明该蛋白具有抗原性,测定蛋白浓度为1.604mg/mL3.间接ELISA方法的建立及评价用4BV gD蛋白作为抗原,建立检测MBV血清抗体的间接ELISA方法,确定的最佳反应条件为：抗原1：1280稀释(浓度为2.913μg/孔)；血清1：100稀释,作用60min；酶标抗体1：20000稀释,作用60min,底物显色15min。OD值≥0.326判为阳性,OD值≤0.255判为阴性。实验证明gD蛋白不与SRV.SIV发生交叉反应,所建立的方法与全病毒试剂盒检测结果的符合率为96.74%,批内重复试验中阴、阳对照的OD值变异系数小于14%。应用该方法检测2016年上海地区送检的37份猴血清,检出阳性1份,阳性率为2.703%。用SRVp27蛋白作为抗原,建立检测SRV血清抗体的间接ELISA方法,确定的最佳反应条件为：抗原1：640稀释(浓度为3.193μg/孔)；血清1：100稀释,作用6Omin；酶标抗体1：20000稀释,作用60min,底物显色15min。OD值≥0.297判为阳性,OD值_0.244判为阴性。实验证明p27蛋白不与MBV.SIV发生交叉反应,所建立的方法与全病毒试剂盒检测结果的符合率为97.87%,批内重复试验中阴、阳对照的OD值变异系数小于9%。应用该方法检测2016年上海地区送检的37份猴血清,检出阳性2份,阳性率为5.405%。用SIV p27蛋白作为抗原,建立检测SIV血清抗体的间接ELISA方法,确定的最佳反应条件为：抗原1：640稀释(浓度为2.508μg/孔)；血清1：100稀释,作用60min;酶标抗体1：10000稀释,作用60min,底物显色15min。OD值≥0.269判为阳性,OD值≤0.256判为阴性。实验证明p27蛋白不与MBV、SRV发生交叉反应,所建立的方法与全病毒试剂盒检测结果的符合率为98.91%,批内重复试验中阴、阳对照的OD值变异系数小于3%。应用该方法检测2016年上海地区送检的37份猴血清,检出阳性0份,阳性率为0。
【关键词】：猴B病毒 猴D型逆转录病毒 猴免疫缺陷病毒 间接ELISA
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 第1章 文献综述10-22
• 1. MBV研究进展10-15
• 1.1 MBV的溯源及命名10
• 1.2 MBV的生物学特征10-12
• 1.3 MBV的感染状况12-13
• 1.4 MBV的检测方法13-15
• 1.5 MBV的预防及治疗15
• 2. SRV研究进展15-18
• 2.1 SRV的溯源15-16
• 2.2 SRV的基因组特征16
• 2.3 SRV的血清型16-17
• 2.4 SRV的感染及传播17
• 2.5 SRV的诊断17
• 2.6 SRV的治疗和预防17-18
• 3. SIV研究进展18-20
• 3.1 SIV的分子生物学特性18
• 3.2 SIV的致病性18-19
• 3.3 SAIDS动物模型的可行性及实用意义19
• 3.4 SIV的检测19-20
• 4. 结语20-22
• 第2章 上海地区实验用猴MBV、SRV、SIV三种病毒的血清抗体调查22-25
• 1. 主要材料22
• 2. 主要仪器22
• 3. 检测结果22-23
• 3.1 MBV血清抗体检测结果22
• 3.2 SRV血清抗体检测结果22-23
• 3.3 SIV血清抗体检测结果23
• 4. 讨论23-25
• 第3章 目的蛋白的表达、纯化及鉴定25-36
• 1. 菌株25
• 2. 主要试剂25
• 3. 主要仪器25
• 4. 实验方法25-27
• 4.1 转化25
• 4.2 小试培养选择最佳的诱导条件25-26
• 4.3 大量诱导26
• 4.4 超声破碎菌体26
• 4.5 镍琼脂糖亲和层析26
• 4.6 SDS-PAGE检测26
• 4.7 Western blot检测26-27
• 4.8 测定目的蛋白浓度27
• 5. 实验结果27-35
• 5.1 MBV gD蛋白表达及检测结果27-29
• 5.2 SRV重组蛋白表达及检测结果29-32
• 5.3 SIV重组蛋白表达及检测结果32-35
• 6. 讨论35-36
• 第4章 检测MBV、SRV、SIV血清抗体的间接ELISA方法的初步建立36-56
• 1. 主要材料及试剂36
• 2. 主要仪器设备36
• 3. 间接ELISA操作程序36
• 4. 间接ELISA方法的初步建立36-38
• 4.1 工作条件摸索试验36-37
• 4.1.1 抗原最适包被量与血清最适稀释度的确定试验36
• 4.1.2 酶标抗体最适工作浓度确定试验36-37
• 4.2 工作条件的优化37
• 4.2.1 最适包被条件的确定试验37
• 4.2.2 血清最适作用时间的确定试验37
• 4.2.3 酶标抗体最适作用时间的确定试验37
• 4.2.4 最适封闭液确定试验37
• 4.2.5 底物最适显色时间确定试验37
• 4.3 判定标准试验37
• 4.4 方法性能评价37-38
• 4.4.1 交叉反应试验37
• 4.4.2 竞争性抑制试验37-38
• 4.4.3 敏感性试验(最低抗体检出效价试验)38
• 4.4.4 批内重复试验38
• 4.4.5 与全病毒ELISA检测试剂盒检测结果比较试验38
• 4.4.6 反应系统保存试验38
• 4.5 间接ELISA方法的应用38
• 5. 实验结果38-53
• 5.1 检测MBV血清抗体的间接ELISA方法的初步建立38-43
• 5.2 检测SRV血清抗体的间接ELISA方法的建立43-48
• 5.3 检测SIV血清抗体的间接ELISA方法的建立48-53
• 6. 讨论53-56
• 结论56-57
• 参考文献57-62
• 附录62-63
• 致谢63-64
• 攻读学位期间发表的学术论文64-65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 叶华虎;袁菊芳;刘欢;范玉筠;;猴B病毒囊膜蛋白gD的B细胞表位预测及鉴定[J];中国比较医学杂志;2014年11期

2 张金阳;孙涛;杨光文;宋玉竹;韩芹芹;夏雪山;;猴B病毒gG蛋白的主要特性与B细胞表位预测[J];昆明理工大学学报(自然科学版);2014年02期

3 熊炜;蒋静;张强;盘宝进;李健;魏晓锋;黄忠荣;胡建华;;猴逆转录病毒RT-PCR和Real-time RT-PCR检测方法的建立[J];动物医学进展;2013年12期

4 王静;张

本文编号：444098