副猪嗜血杆菌lgtB和lex-1基因在脂寡糖合成及致病过程中的作用

发布时间：2017-06-13 09:06

  本文关键词：副猪嗜血杆菌lgtB和lex-1基因在脂寡糖合成及致病过程中的作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是定植于猪上呼吸道的条件性致病菌,临床上常引起以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎等为特征的格拉瑟氏病(Gl?sser’s disease)。由于HPS血清型众多,不同血清型间毒力差异很大,缺乏免疫交叉性,所以至今为止还没有很好的防控副猪嗜血杆菌病的方法。目前国内外学者对HPS致病相关因子进行了诸多研究,发现脂寡糖是潜在的毒力因子之一,可以介导HPS的粘附作用和诱导细胞释放炎性介质。然而与脂寡糖合成相关的基因仍有待深入研究。LgtB/lex-1是HPS基因组上尚待研究的两个基因。在其他菌中已有报道lgtB/lex-1编码β-1,4半乳糖基转移酶,该酶是糖基转移酶家族25(Glycosyltransferase family 25)的成员,参与脂寡糖的合成。因此,本研究旨在分析HPS lgtB/lex-1基因在脂寡糖合成及HPS致病过程中的作用。本研究首先构建了lgtB的缺失突变载体质粒pZQ001和lex-1的缺失突变载体质粒pZQ002,利用自然转化的方法将载体质粒转化亲本菌株HPS SC096分别获得了缺失lgtB基因和lex-1基因的重组菌ΔlgtB株和Δlex-1株;其次构建了互补载体质粒pZQ003和pZQ004,用相同的自然转化方法获得了ΔlgtB-c和Δlex-1-c互补菌株;通过PCR及测序确定菌株构建正确。为了观察lgtB/lex-1基因缺失后脂寡糖的变化,本研究提取了野生菌株和重组菌株的脂寡糖,通过SDS-PAGE及银染等方法进行分析。结果显示ΔlgtB和Δlex-1缺失株的脂寡糖的泳动速度均明显快于野生菌株,表明lgtB/lex-1基因缺失后菌株的脂寡糖分子量变小,脂寡糖链的长度在基因缺失之后变短,说明lgtB/lex-1基因参与脂寡糖的合成。而互补菌株ΔlgtB-c和Δlex-1-c的脂寡糖的泳动速度和野生菌株一致,说明lgt B/lex-1互补成功。本文研究了lgtB/lex-1基因缺失后对菌株抵抗补体介导的血清杀伤作用的影响。结果表明在缺失lgtB/lex-1后HPS的存活率由亲本株的74.92%分别降至15.00%和54.46%,差异显著,这表明两个基因缺失后菌株对抗血清杀伤作用的能力降低;互补lex-1后的菌株存活率与亲本株相比无显著差异,而ΔlgtB-c互补菌株的存活率降为8.51%,和亲本株相比下降了约10倍,差异显著。为了探讨Δlgt B-c互补菌株血清敏感性升高的原因,运用荧光定光PCR方法检测lgtB的表达量,结果发现ΔlgtB-c互补株中lgtB的转录水平是亲本株的27.05倍,说明lgt B基因在互补菌株中表达过量,这种对补体更为敏感的表型可能与lgtB过表达有关。副猪嗜血杆菌致病的重要机制之一是粘附和入侵宿主细胞。因此本研究测定了ΔlgtB和Δlex-1缺失株对猪肾上皮细胞(PK-15)的粘附和入侵能力。结果表明和野生型菌株相比,ΔlgtB、Δlex-1缺失株的粘附和入侵能力都有显著的下降,意味着lgtB/lex-1基因缺失后会导致菌株粘附入侵宿主细胞的能力下降。最后,本研究用ΔlgtB缺失株通过腹腔接种的方式感染250g左右健康普通级豚鼠,并与亲本株SC096比较毒力差异。结果显示感染SC096组豚鼠出现食欲、饮水量下降,精神不振,被毛粗乱、呼吸困难等临床症状,但感染ΔlgtB缺失株组豚鼠无明显临床症状;感染SC096组豚鼠腹腔中有较多纤维素性渗出液,肝脏、胃,小肠表面都出现白色纤维素渗出,而感染ΔlgtB缺失株组豚鼠无明显眼观病理变化,腹腔内没有出现纤维素性渗出物。结果表明ΔlgtB缺失株与其亲本株SC096相比,毒力有明显减弱。
【关键词】：副猪嗜血杆菌 lgtB lex-1 血清抗性 粘附 入侵 毒力
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 常用缩略词（Abbreviation）8-13
• 1 前言13-20
• 1.1 副猪嗜血杆菌简介13
• 1.2 副猪嗜血杆菌致病机制研究进展13-14
• 1.3 副猪嗜血杆菌致病相关因子14-18
• 1.3.1 荚膜与脂多糖在HPS致病过程中的作用14-16
• 1.3.2 外膜蛋白在HPS致病过程中的作用16-17
• 1.3.3 其他因子在HPS致病过程中的作用17-18
• 1.4 脂寡糖合成相关基因研究进展18
• 1.5 Lgt B、lex-1 的相关研究18-19
• 1.6 研究目的和意义19-20
• 第一章 副猪嗜血杆菌lgt B、lex-1 基因缺失株及互补菌株的构建20-34
• 1 材料与方法20-28
• 1.1 材料20-22
• 1.1.1 菌株和质粒20
• 1.1.2 主要试剂20
• 1.1.3 溶液的配制20-21
• 1.1.4 主要仪器21
• 1.1.5 引物21-22
• 1.2 方法22-28
• 1.2.1 细菌的培养和PCR模板的制备22
• 1.2.2 Lgt B和lex-1 基因缺失株的构建22-25
• 1.2.2.1 Lgt B、lex-1 基因上臂和下臂的扩增22-23
• 1.2.2.2 Lgt B、lex-1 上下臂的连接23-24
• 1.2.2.3 连接产物的转化24-25
• 1.2.2.4 自然转化SC096菌株25
• 1.2.3 互补菌株的构建25-28
• 1.2.3.1 PSF116中间载体的构建25-26
• 1.2.3.2 互补载体p ZQ003和p ZQ004的构建26-27
• 1.2.3.3 自然转化 Δlgt B和 Δlex-1 菌株27-28
• 2 结果与分析28-32
• 2.1 缺失载体的构建28-29
• 2.2 互补载体的构建29-30
• 2.3 缺失株 Δlgt B、Δlex-1 和互补株 Δlgt B-c、Δlex1c的鉴定及分析30-32
• 3 讨论32-33
• 4 结论33-34
• 第二章 副猪嗜血杆菌 Δlgt B和 Δlex-1 缺失株的致病特性研究34-49
• 1 材料与方法34-41
• 1.1 材料34-36
• 1.1.1 菌株34
• 1.1.2 实验动物34
• 1.1.3 主要试剂34
• 1.1.4 溶液的配制34-35
• 1.1.5 主要仪器35-36
• 1.2 方法36-41
• 1.2.1 副猪嗜血杆菌的复壮及培养36
• 1.2.2 生长曲线的测定36
• 1.2.3 脂多糖的变化36-37
• 1.2.3.1 脂多糖的抽提36
• 1.2.3.2 SDS-PAGE36-37
• 1.2.3.3 银染37
• 1.2.4 补体介导的血清杀菌试验37-38
• 1.2.5 PK-15 的粘附入侵38-40
• 1.2.5.1 细胞培养38
• 1.2.5.2 细胞粘附试验38
• 1.2.5.3 细胞入侵试验38-39
• 1.2.5.4 Real-Time PCR 检测 lgtB 转录水平39-40
• 1.2.6 豚鼠感染试验40
• 1.2.6.1 细菌计数40
• 1.2.6.2 感染豚鼠40
• 1.2.6.3 临床症状、病理变化40
• 1.2.7 数据分析40-41
• 2 结果与分析41-45
• 2.1 野生型SC096和缺失菌株的生长曲线的鉴定及分析41
• 2.2 脂寡糖的鉴定及分析41-42
• 2.3 血清杀菌试验的结果及分析42-43
• 2.4 粘附和入侵PK-15 细胞的能力43-44
• 2.5 豚鼠感染试验的结果及分析44-45
• 3 讨论45-48
• 3.1 Lgt B、lex-1 基因缺失株的生长曲线变化46
• 3.2 Lgt B、lex-1 基因缺失株的脂寡糖变化46-47
• 3.3 Lgt B、lex-1 基因缺失株的血清抗性47-48
• 3.4 Lgt B、lex-1 基因缺失菌株的粘附入侵能力48
• 3.5 Lgt B基因缺失株感染豚鼠结果分析48
• 4 结论48-49
• 致谢49-50
• 参考文献50-58
• 附录 158-59
• 附录 259-60
• 附录 360

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 赵倩;汤承;杨发龙;邵国青;岳华;;副猪嗜血杆菌ompP2基因的结构特征及其与毒力的联系[J];中国科学:生命科学;2010年06期

2 高鹏程;储岳峰;赵萍;贺英;逯忠新;;豚鼠副猪嗜血杆菌感染动物模型的建立[J];中国预防兽医学报;2009年12期

3 高鹏程;储岳峰;赵萍;贺英;逯忠新;;副猪嗜血杆菌感染豚鼠试验及在其体内的分布[J];畜牧兽医学报;2009年09期

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本文编号：446166