ANKRD23与长非编码RNA-AK004293对肌细胞分化相关基因的表达调控

发布时间：2017-06-14 23:05

  本文关键词：ANKRD23与长非编码RNA-AK004293对肌细胞分化相关基因的表达调控，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肌纤维形成是一个复杂过程,受到多种蛋白编码基因和非编码RNA的精细调控。在本实验室前期研究结果基础上,我们获得了一个在骨骼肌高表达的lncRNA-AK004293,该lncRNA与ANKRD23基因3’UTR重叠。本研究利用RNA干扰技术和超表达技术在C2C12成肌细胞中研究了lncRNA-AK004293对ANKRD23表达的影响,以及这两个基因对肌细胞分化相关基因表达的影响。主要研究结果如下:1.采用实时定量PCR、Western blotting技术检测了超表达和干涉AK004293基因后肌细胞分化相关基因MyoD、MyoG和MyHC的表达变化及ANKRD23的表达变化;发现了AK004293对肌细胞分化相关基因与ANKRD23的表达都没有显著影响。2.采用实时定量PCR、Western blotting技术检测了超表达和干涉ANKRD23基因后肌细胞分化相关基因MyoD、MyoG和MyHC的表达变化;发现干涉ANKRD23后增强了MyoD、MyoG和MyHC的表达,超表达ANKRD23后减弱了上述基因的表达,表明ANKRD23对肌细胞分化有负调节作用。本研究结果为进一步研究肌细胞中ANKRD23的功能及其调控机制奠定了基础。
【关键词】：长非编码RNA ANKRD23 成肌细胞分化 RNAi 超表达
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.2
【目录】：

• 摘要7-8
• Abstract8-9
• 缩略词表9-10
• 第一章 文献综述10-22
• 1 骨骼肌形成的分子调控机制10-12
• 1.1 骨骼肌发育相关的基因家族10
• 1.2 骨骼肌形成的上游调控因子—Pax家族10-11
• 1.3 MicroRNA在骨骼肌发育中的功能11-12
• 2 LncRNA的功能及作用机制12-19
• 2.1 LncRNAs的功能12-14
• 2.1.1 调控等位基因的表达：X染色体失活12
• 2.1.2 调控等位基因的表达：基因印记12-13
• 2.1.3 在发育中的作用13-14
• 2.1.4 在癌症中的作用14
• 2.2 LncRNA的作用机制14-19
• 2.2.1 增强子RNA与染色质成环15-16
• 2.2.2 印记基因中的lncRNA16-17
• 2.2.3 LncRNA的剂量补偿效应17
• 2.2.4 反义lncRNA转录抑制基因表达17-18
• 2.2.5 LncRNA的自调控18-19
• 3 MARP家族中ANKRD23的研究进展19-22
• 第二章 目的意义22-23
• 第三章 材料和方法23-40
• 1 实验材料23-28
• 1.1 实验样品23
• 1.2 主要仪器和设备23-24
• 1.3 主要试剂与试剂盒24-25
• 1.4 试剂配制25-26
• 1.5 应用的生物信息学网站及分析软件26-27
• 1.6 载体27-28
• 2 试验方法28-40
• 2.1 细胞培养28-29
• 2.1.1 细胞的复苏28
• 2.1.2 C2C12细胞的增殖培养28
• 2.1.3 C2C12细胞的分化培养28-29
• 2.1.4 细胞的冻存29
• 2.2 C2C12细胞总RNA的提取和cDNA的制备29-30
• 2.3 AK004293超表达载体的构建30-34
• 2.3.1 小鼠AK004293 cDNA的克隆30-32
• 2.3.2 琼脂糖凝胶电泳和成像32
• 2.3.3 PCR产物的胶回收和克隆测序32-34
• 2.3.4 质粒提取34
• 2.3.5 pcDNA3.1-AK004293真核表达载体的酶切鉴定34
• 2.4 ANKRD23超表达载体的构建34-35
• 2.5 AK004293-siRNA干涉片段的选取35
• 2.6 脂质体介导的细胞转染(6 孔板)35-36
• 2.7 Quantitative real-time PCR分析36-37
• 2.8 Western blotting分析37-40
• 2.8.1 蛋白提取37
• 2.8.2 BCA蛋白浓度测定37
• 2.8.3 SDS-PAGE电泳37-38
• 2.8.4 转膜38
• 2.8.5 封闭38
• 2.8.6 免疫反应38
• 2.8.7 ECL化学发光检测38-40
• 第四章 结果与分析40-49
• 1 ANKRD23与AK004293在成肌细胞分化过程中的表达变化40-41
• 1.1 RNA水平的表达变化40
• 1.2 蛋白水平的表达变化40-41
• 2 AK004293的干扰片段筛选41-42
• 3 siRNA对AK004293基因的干扰效果及其对肌细胞分化标志基因表达的影响42-43
• 4 pcDNA3.1-AK004293载体构建及其对肌细胞分化标志基因表达的影响43-45
• 4.1 AK004293超表达载体的鉴定43
• 4.2 超表达AK004293后肌细胞分化标志基因表达量的变化43-45
• 5 siRNA对ANKRD23基因的干扰效果及及其对肌细胞分化标志基因表达的影响45-47
• 6 pcDNA3.1-ANKRD23载体构建及其对肌细胞分化标志基因表达的影响47-49
• 6.1 ANKRD23超表达载体的鉴定47
• 6.2 超表达ANKRD23后肌细胞分化标志基因表达量的变化47-49
• 第五章 讨论49-52
• 1 关于ANKRD23及与其 3’ UTR重叠的lncRNA AK004293之间的关系49-50
• 2 关于RNAi技术50
• 3 关于干扰和超表达ANKRD23对成肌细胞分化的影响50-51
• 4 下一步计划51-52
• 小结52-53
• 参考文献53-60
• 致谢60

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