重组铜绿假单胞杆菌延长因子Tu与脂蛋白（a）的相互作用

发布时间：2017-06-14 21:12

  本文关键词：重组铜绿假单胞杆菌延长因子Tu与脂蛋白（a）的相互作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa)表面的翻译延长因子Tu (Elongation factor Tu, Tu)可与人纤溶酶原(Plasminogen, Plg)特异性结合,这种结合态的Pig被激活后可降解宿主胞外基质,有利于致病菌穿越组织屏障。本实验室提出,由于脂蛋白(a)[Lipoprotein(a), Lp(a)]中的apo(a)与Pig具有高度同源性,可以抑制病菌与Pig的结合,因此可能具有潜在的抗感染作用。为验证Lp(a)是否可与铜绿假单胞杆菌表面Tu特异性结合,进而竞争性抑制Pig与Tu的结合,本文进行了如下研究：(1)在大肠杆菌中表达并纯化了重组Tu (Recombinant Tu,rTu)蛋白及重组TA蛋白(Recombinant TuK394A, rTA),通过ELISA实验发现：①rTu、rTA蛋白与Pig、Lp(a)结合,与低密度脂蛋白(Low density lipoprotein, LDL)不结合,表明rTu与Lp(a)的结合可能与apo(a)有关。②赖氨酸类似分子6氨基己酸(ε-aminocaproic acid, EACA)对rTu蛋白与Pig、Lp(a)的结合有一定的抑制作用,表明rTu蛋白可能是与Pig、Lp上的赖氨酸结合位点(Lysine-binding sites, LBS)有关。③较高浓度的Lp(a)能抑制Pig与rTu的结合,表明Pig及Lp(a)与rTu的结合位点有相同之处。(2) ELISA实验发现：①Pig、Lp(a)和LDL都可以与铜绿假单胞杆菌结合,且不同生长时期菌的结合值无显著差异。②EACA对铜绿假单胞杆菌与Pig、Lp(a)的结合有一定的抑制作用,表明其结合与Pig、Lp上的上的LBS有关。(3)制备并纯化得到鼠抗rTu多克隆抗体(Mouse anti-rTu IgG, rTu抗体)。通过ELISA实验发现：①rTu抗体能抑制rTu与Lp(a)的结合。②不同生长时期铜绿假单胞杆菌表面Tu表达量有差异,但因该菌表面还有其他Lp(a)结合蛋白,因而不同生长时期的铜绿假单胞杆菌与Lp(a)的结合能力并无显著差异。
【关键词】：脂蛋白(a) 纤溶酶原 铜绿假单胞杆菌 延长因子Tu
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-12
• 缩略语表12-13
• 1 引言13-25
• 1.1 铜绿假单胞杆菌13-16
• 1.1.1 铜绿假单胞杆菌的毒力因子13-15
• 1.1.2 铜绿假单胞杆菌的Ⅲ型分泌系统15-16
• 1.1.3 铜绿假单胞杆菌多重耐药性的基础16
• 1.2 纤溶酶原与病原入侵16-19
• 1.2.1 纤溶酶原的结构和功能16-18
• 1.2.2 病原菌利用宿主Plg的机制18-19
• 1.3 铜绿假单胞杆菌表面的纤溶酶原受体19-21
• 1.3.1 铜绿假单胞杆菌表面的纤溶酶原受体19-20
• 1.3.2 铜绿假单胞杆菌延长因子Tu结构20-21
• 1.4 脂蛋白(a)21-23
• 1.4.1 Lp(a)结构21-22
• 1.4.2 Lp(a)在纤溶系统中的作用22
• 1.4.3 脂蛋白(a)的致病性22-23
• 1.5 立题依据23
• 1.6 研究内容23-25
• 1.6.1 铜绿假单胞杆菌与Lp(a)的结合24
• 1.6.2 重组铜绿假单胞杆菌翻译延长因子Tu与Lp(a)的结合24-25
• 2 实验材料25-31
• 2.1 仪器设备25
• 2.2 主要试剂25-31
• 2.2.1 化学试剂25-27
• 2.2.2 试剂盒和标准品27
• 2.2.3 填料及纯化缓冲液27-29
• 2.2.4 培养基的配制29-30
• 2.2.5 菌株及实验动物30
• 2.2.6 PCR引物30-31
• 3 实验方法31-48
• 3.1 rTu的表达、纯化31-38
• 3.1.1 铜绿假单胞杆菌的培养31
• 3.1.2 铜绿假单胞杆菌基因组DNA的提取31-32
• 3.1.3 基因组DNA的测定32
• 3.1.4 Tu的扩增32
• 3.1.5 Tu扩增产物的纯化32-33
• 3.1.6 Tu与pGM-T的连接33
• 3.1.7 pGM-T-Tu转化感受态E.coli33
• 3.1.8 菌落PCR鉴定阳性克隆33-34
• 3.1.9 基因序列测定34
• 3.1.10 Tu的酶切及纯化34
• 3.1.11 提取pASK-IBA37质粒34-35
• 3.1.12 pASK-IBA 37的酶切及纯化35
• 3.1.13 Tu基因酶切产物与pASK-IBA 37载体的连接35-36
• 3.1.14 pASK-IBA37-Tu转化感受态E.coli BL2136
• 3.1.15 菌落PCR鉴定阳性克隆36
• 3.1.16 阳性克隆的双酶切鉴定36
• 3.1.17 工程菌培养36-37
• 3.1.18 表达产物的分析37
• 3.1.19 rTu的纯化37-38
• 3.1.20 蛋白浓度的测定38
• 3.2 rTA的表达和纯化38-39
• 3.2.1 TA的扩增及纯化38-39
• 3.2.2 TA的酶切及纯化39
• 3.2.3 TA与pASK-IBA37的连接39
• 3.2.4 pASK-IBA37-TA转化感受态E.coli39
• 3.2.5 菌落PCR鉴定阳性克隆39
• 3.2.6 基因序列的测定39
• 3.2.7 工程菌的培养39
• 3.2.8 表达产物的SDS-PAGE分析39
• 3.2.9 rTA的纯化39
• 3.2.10 蛋白浓度的测定39
• 3.3 rT1或rT2的表达和纯化39-40
• 3.3.1 T1、T2的扩增及纯化39-40
• 3.3.2 T1或T2的酶切及纯化40
• 3.3.3 T1或T2与pASK-IBA37的连接40
• 3.3.4 pASK-IBA37-T1或pASK-IBA37-T2转化感受态E.coli40
• 3.3.5 菌落PCR鉴定阳性克隆40
• 3.3.6 基因序列的测定40
• 3.3.7 工程菌的培养40
• 3.3.8 表达产物的SDS-PAGE分析40
• 3.3.9 rT1或rT2的纯化40
• 3.3.10 蛋白浓度的测定40
• 3.4 探索铜绿假单胞杆菌与Lp(a)的相互作用40-42
• 3.4.1 检测铜绿假单胞杆菌与Plg或Lp(a)的结合40-41
• 3.4.2 检测EACA对铜绿假单胞杆菌与Plg或Lp(a)结合的作用41-42
• 3.5 探索rTu与Lp(a)的相互作用42-43
• 3.5.1 检测rTu与Plg、Lp(a)或LDL的结合42-43
• 3.5.2 检测EACA对rTu与Pig或Lp(a)结合的抑制作用43
• 3.5.3 检测Lp(a)对rTu与Plg结合的抑制作用43
• 3.6 检测rTu、rTA、rT1或rT2与Plg或Lp(a)的结合43-44
• 3.6.1 检测rTu、rTA、rT1或rT2与Plg的结合44
• 3.6.2 检测rTu、rTA、rT1或rT2与Lp(a)的结合44
• 3.7 rTu抗体的制备及纯化44-46
• 3.7.1 免疫用试剂的制备44
• 3.7.2 rTu免疫小鼠44-45
• 3.7.3 rTu抗体的纯化45
• 3.7.4 检测rTu抗体的稀释比45-46
• 3.8 用rTu抗体研究rTu或铜绿假单胞杆菌与Lp(a)的相互作用46-48
• 3.8.1 检测不同生长时期铜绿假单胞杆菌表面Tu的表达量46
• 3.8.2 检测rTu抗体对铜绿假单胞杆菌与Lp(a)结合的作用46-48
• 4 结果48-68
• 4.1 rTu的表达和纯化48-55
• 4.1.1 铜绿假单胞杆菌在TSB培养基中的生长曲线48
• 4.1.2 铜绿假单胞杆菌基因组DNA的提取48-49
• 4.1.3 pGM-T质粒示意图49
• 4.1.4 Tu基因的扩增49
• 4.1.5 重组质粒pGM-T-Tu的构建49-50
• 4.1.6 菌落PCR鉴定阳性克隆50
• 4.1.7 Tu序列测定结果50-51
• 4.1.8 pASK-IBA37载体51
• 4.1.9 pASK-IBA37的酶切及纯化51-52
• 4.1.10 Tu的双酶切及纯化52
• 4.1.11 Tu与pASK-IBA37的连接52
• 4.1.12 菌落PCR鉴定阳性转化菌落52-53
• 4.1.13 BamHI、EcoRI双酶切pASK-IBA37-Tu质粒53
• 4.1.14 表达产物的分析53-54
• 4.1.15 rTu的纯化54
• 4.1.16 蛋白含量的测定54-55
• 4.2 rTA的表达和纯化55-56
• 4.2.1 TA的扩增及纯化55
• 4.2.2 菌落PCR鉴定阳性克隆55-56
• 4.2.3 TA序列测定结果56
• 4.2.4 rTA的表达纯化56
• 4.2.5 蛋白含量的测定56
• 4.3 rT1、rT2的表达和纯化56-58
• 4.3.1 T1、T2的扩增及纯化56-57
• 4.3.2 菌落PCR鉴定T1或T2阳性克隆57
• 4.3.3 rT1、rT2的表达纯化57-58
• 4.3.4 蛋白浓度的测定58
• 4.4 探索铜绿假单胞杆菌与Lp(a)的相互作用58-60
• 4.4.1 检测铜绿假单胞杆菌与Plg或Lp(a)的结合58-59
• 4.4.2 检测EACA对铜绿假单胞杆菌与Plg或Lp(a)结合的作用59-60
• 4.5 rTu与Lp(a)的相互作用60-63
• 4.5.1 ELISA检测rTu与Plg、Lp(a)或LDL的结合60-61
• 4.5.2 检测EACA对rTu与Plg或Lp(a)结合的作用61-62
• 4.5.3 检测Lp(a)对rTu与Plg结合的作用62-63
• 4.6 ELISA检测rTA、rT1或rT2与Plg或Lp(a)的相互作用63-64
• 4.6.1 ELISA检测rTu、rTA、rT1或rT2与Plg的结合63
• 4.6.2 ELISA检测rTu、rTA、rT1或rT2与Lp(a)的结合63-64
• 4.7 rTu抗体的制备和纯化64
• 4.8 探索rTu抗体的稀释比64-66
• 4.8.1 rTu抗体与rTu结合时的稀释比64-65
• 4.8.2 rTu抗体与铜绿假单胞杆菌结合时的稀释比65-66
• 4.9 rTu抗体对rTu或铜绿假单胞杆菌与Lp(a)结合的作用66-68
• 4.9.1 不同生长时期铜绿假单胞杆菌表面Tu表达量的差异66
• 4.9.2 rTu抗体对铜绿假单胞杆菌或rTu与Lp(a)结合的作用66-68
• 5 讨论68-69
• 6 结论69-70
• 致谢70-71
• 参考文献71-75
• 附录75-80
• 作者简介80

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