OmpX过表达对肠外致病性大肠杆菌ΔtolC株生物被膜形成特性的影响

发布时间：2017-06-17 12:04

  本文关键词：OmpX过表达对肠外致病性大肠杆菌ΔtolC株生物被膜形成特性的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli,ExPEC)作为一种重要的人兽共患病病原和食源性致病菌而备受关注。它可通过污染食物、水源和饲料等造成传播,引起人和动物的肠外组织感染。而生物被膜形成增强了其多重耐药性和体内外抗逆特性,更增加其防控难度。因此,必须加强对细菌生物被膜形成机制及影响因子的研究,以便制定有效的防控策略。外膜蛋白TolC作为革兰氏阴性菌多种外排泵系统的主要组成部分,不仅介导进入细胞内的分子外排和自身代谢分子、毒素分子的外排,而且在维持外膜完整性和生物被膜形成过程中也具有重要的作用。本实验室前期研究表明TolC参与ExPEC对外界高渗环境的响应性,并通过调节Curli菌毛的合成而影响生物被膜的形成。从蛋白水平研究表明tolC基因缺失可导致外膜蛋白OmpX表达显著降低。OmpX作为毒力蛋白可参与细菌的致病过程,介导细菌对上皮细胞的黏附和入侵,并参与细菌对外界环境渗透压的适应性。是否OmpX介导TolC失活对ExPEC高渗环境响应性和生物被膜形成的作用?业已证明ompX缺失不影响ExPEC生物被膜形成,故本研究通过在△tolC突变菌株中导入OmpX过表达质粒,进一步探讨OmpX过表达对△tolC株生物被膜形成特性的影响。主要研究结果如下:1.高渗培养条件下ExPEC Omp X表达分析:qRT-PCR检测发现,在NaCl和蔗糖形成的高渗培养基条件下,ExPEC OmpX的表达量明显升高,提示OmpX表达可能是ExPEC对环境高渗应激的一种响应机制。2.OmpX过表达菌株的构建及其生物学特性的研究:构建了ompX全长基因表达质粒pHSG396:ompX,采用电转化方法分别导入ExPEC PPECC42野生株(WT)及其△tolC菌株,构建两种亲本株的OmpX过表达菌株。生长曲线结果表明,OmpX过表达不影响菌株在M9、1/2M9完全培养基和LB培养基中的生长速度。对试验菌株最低抑菌浓度(MIC)检测结果表明,TolC失活可造成ExPEC对环丙沙星、头孢噻肟、四环素、阿米卡星、SDS的耐药性得到明显改善,但TolC失活同时过表达OmpX时可恢复细菌对这几种药物的耐受性。体外细胞致病试验结果表明,tolC缺失引起ExPEC对人肺上皮细胞A549黏附侵袭能力和在小鼠巨噬细胞RAW264.7的存活能力显著减弱,但同时过表达OmpX后可部分恢复tolC缺失引起的这些作用。3.OmpX过表达对菌株生物被膜形成和Curli合成的影响:采用结晶紫染色法评价了试验菌株的生物被膜形成能力,结果表明在1/2M9低渗培养条件下,WT、△tolC及其OmpX过表达菌株均呈现强生物被膜形成能力;但在M9高渗培养基中,△tolC呈现弱生物被膜形成能力,但△tolC::ompX恢复了与WT相一致的强生物被膜形成能力。进而检测了试验菌株在1/2M9培养基中添加不同浓度NaCl或蔗糖形成高渗条件下的生物被膜形成能力,结果显示tolC缺失可导致Ex PEC生物被膜形成能力对高渗环境的抵抗能力减弱,但△tolC::ompX可部分或全部恢复菌株生物被膜形成能力对高渗环境的抵抗。Curli菌毛是ExPEC生物被膜形成的关键成分。本研究采用刚果红平板试验分析了试验菌株的Curli菌毛合成能力,结果显示:在M9培养基中,△tolC株呈现缺乏Curli菌毛的saw菌落表型,而△tolC::ompX株呈现与WT株相似的可形成Curli菌毛的rdar菌落表型;但在1/2M9培养基中试验菌株均呈现rdar菌落表型。进而qRT-PCR检测结果证实,OmpX过表达对△tolC株Curli菌毛合成能力的代偿是由于调控Curli合成相关基因csgB和csgD的转录水平。4.转录组学技术筛选TolC和OmpX调节生物被膜形成的靶标:为进一步探讨TolC和OmpX参与高渗环境抗性和生物被膜形成的分子机制,本研究采用RNA-seq技术从转录组学水平分析了高盐和高糖培养条件下WT、△tolC与△tolC::ompX菌株之间的差异表达基因,筛选到一系列生物被膜形成和细菌抗渗透性相关基因,包括转录调节因子、多压力反应蛋白Bhs A、以及cpx双组份信号系统辅助蛋白CpxP等。总之,ExPEC外膜蛋白OmpX可能通过上调表达响应环境应激,参与细菌生物被膜的形成;过量表达OmpX可弥补TolC缺失造成的细菌Curli菌毛和生物被膜形成能力的缺陷。根据转录组测序分析结果,过量表达OmpX对TolC缺失株高渗耐受性和生物被膜的补偿作用可能主要通过调节双组份系统和压力反应系统来完成。
【关键词】：ExPEC 生物被膜 Curli菌毛 高渗应激 TolC OmpX
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 缩略词（ABBREVIATION）11-13
• 1 文献综述13-24
• 1.1 肠外致病性大肠杆菌概述13-16
• 1.1.1 大肠杆菌的简介和分类13-14
• 1.1.2 肠外致病性大肠杆菌概述14
• 1.1.3 肠外致病性大肠杆菌的流行病学分析14
• 1.1.4 肠外致病性大肠杆菌的主要致病机制14-15
• 1.1.5 肠外致病性大肠杆菌的诊断和防治15-16
• 1.2.生物被膜概述16-20
• 1.2.1.生物被膜概述及危害16
• 1.2.2.生物被膜的形成过程及主要的参与因子16-19
• 1.2.3 生物被膜形成的调节机制19-20
• 1.2.4 大肠杆菌生物被膜的控制和清除20
• 1.3.大肠杆菌外膜蛋白概述20-24
• 1.3.1.外膜蛋白简介、结构、分类及功能20-21
• 1.3.2.外膜蛋白Tol C概述21-22
• 1.3.3 外膜蛋白Omp X概述22-24
• 2.研究目的和意义24-25
• 3.材料与方法25-35
• 3.1 材料25-28
• 3.1.1 菌株和质粒25-26
• 3.1.2 主要试剂、试剂盒与仪器26-27
• 3.1.3 主要培养基、抗生素及相关溶液的配置27-28
• 3.2 方法28-35
• 3.2.1 引物设计与合成28-29
• 3.2.2 猪源Ex PEC的复苏增殖和基因组DNA提取29
• 3.2.3 质粒的小量制备29
• 3.2.4 电转感受态细胞的制备29
• 3.2.5 WT::omp X和△tol C::omp X菌株的构建29-30
• 3.2.6 试验菌株生长特性的测定30
• 3.2.7 试验菌株对抗菌药物最小抑菌浓度（MIC）的测定30-31
• 3.2.8 细胞黏附侵袭能力测定31
• 3.2.9 巨噬细胞内存活能力测定31
• 3.2.10 生物被膜形成能力测定31-32
• 3.2.11 Curli合成能力的评价32
• 3.2.12 高渗应激环境对生物被膜的形成能力的影响32
• 3.2.13 Curli菌毛转录水平验证32-33
• 3.2.14 q RT-PCR验证高渗条件Omp X的表达量33-34
• 3.2.15 转录组分析差异基因34
• 3.2.16 数据分析34-35
• 4.结果与分析35-46
• 4.1 PPECC42全基因组测序35
• 4.2 过表达菌株的构建并验证表达35-36
• 4.3 生长特性评价测定36-37
• 4.3.1 遗传稳定性评价36-37
• 4.3.2 生长曲线测定37
• 4.4 最小抑菌浓度（MIC）测定37-38
• 4.5 细胞黏附侵袭能力分析38
• 4.6 巨噬细胞内存活能力分析38-39
• 4.7 生物被膜形成能力分析39-42
• 4.7.1 生物被膜形成能力分析39-40
• 4.7.2 高渗应激对生物被膜形成的影响40
• 4.7.3 Curli合成能力评价40-41
• 4.7.4 q RT-PCR验证Curli合成相关基因csg D和csg B的转录表达41-42
• 4.8 q RT-PCR检测高渗条件下Omp X的表达量42
• 4.9 转录组分析差异基因42-46
• 4.9.1 差异基因表达分析42-43
• 4.9.2 靶标差异基因的筛选43-46
• 5 讨论46-49
• 5.1 Omp X与Tol C相互作用调节细菌抗渗透应激和生物被膜的形成46
• 5.2 转录组学测序寻找在生物被膜和抗渗透方面的差异基因46-47
• 5.3 差异基因cpx P和bhs A在生物被膜和抗渗透方面的功能47-49
• 6 结论49-50
• 参考文献50-61
• 附录61-62
• 致谢62

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