类弹性蛋白多肽融合犬干扰素的表达、纯化和活性检测

发布时间：2017-06-17 13:12

  本文关键词：类弹性蛋白多肽融合犬干扰素的表达、纯化和活性检测，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：干扰素(interferon, IFN)是一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节的作用的细胞因子,其中犬重组α干扰素已广泛应用于犬病毒性疾病的治疗,并获得良好的治疗效果。但现有的重组α干扰素多以组氨酸标签融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体表达并经过变性、复性和层析纯化的方式制备。此方法制备的重组α干扰素不仅价格高,且体内半衰期短。延长干扰素体内半衰期的常见方式有聚乙二醇化和与血清白蛋白等蛋白标签进行融合表达,前者反应条件和产品质量控制困难,后者仍然需要使用亲和层析等成本较高的方法纯化。类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide, ELP)是一类由五个氨基酸组成的聚合物,具有温度敏感的可逆相变特性,可用离心等简单方法分离纯化,已被用作重组蛋白的纯化标签。另外,由于良好的生物相容性,ELP还被用作体内药物载体,以起缓释和延长半衰期的作用。犬IL-29(CaIL-29)抗病毒作用有别于CaIFN-α,目前尚无基因工程产品上市。犬γ干扰素(CaIFN-γ)除具有抗病毒作用,还有免疫调节作用。本研究用PCR扩增CaIL-29和CaIFNα1成熟肽编码序列,将其分别插入ELP融合表达载体pET-ELP,获得重组表达载体pCaIL29-ELP和pELP-CaIFNα。再将合成的CaIFN-γ成熟肽序列插入pELP-CaIFNα中,获得CaIFN-α与CaIFN-γ融合表达载体pELP-CaIFNαγ。分别将重组载体转化BLR(DE3)和BL21(DE3)大肠杆菌,在37℃用IPTG诱导融合蛋白表达。SDS-PAGE分析结果显示：pCaIL29-ELP、pELP-CaIFNα和pELP-CaIFNaγ重组菌均表达预期大小的融合蛋白,其中CaIL29-ELP融合蛋白为不溶性包涵体,ELP-CaIFNα和ELP-CaIFNαγ为可溶性表达。然后在优化条件下进行CaIL29-ELP融合蛋白诱导表达,SDS-PAGE分析结果显示在低于26℃条件下为可溶性表达。在此基础上对IPTG诱导浓度和时间进行了优化,CaIL29-ELP、 pELP-CaIFNα和ELP-CaIFNαγ的最佳诱导表达条件为0.2mM IPTG、24℃和24h。分别在优化条件下进行CaIL29-ELP、ELP-CaIFNα和ELP-CaIFNαγ诱导表达,对纯化融合蛋白的相变温度、盐浓度等相变循环(ITC)参数进行了优化,结果显示CaIL29-ELP、 ELP-CaIFNα和ELP-CaIFNαγ的相变温度分别为26℃、26℃和39℃,最佳氯化钠浓度分别为3mol/L、3mol/L和3mol/L。纯化融合蛋白用6mol/L尿素溶解,透析后进行SDS-PAGE分析,结果显示CaIL29-ELP融合蛋白的纯度为74%,浓度为0.08mg/mL; ELP-CaIFNα融合蛋白的纯度为79%,浓度为0.14mg/mL; ELP-CaIFNαγ融合蛋白的纯度为82%,浓度为0.13mg/mL以MDCK/VSV系统进行干扰素活性检测,结果显示CaIL29-ELP的抗病毒活性为2.5×104U/mg, ELP-CaIFNα的抗病毒效价为1.4×105U/mg, ELP-CaIFNαγ抗病毒效价为8.4×1 03U/mg。这些研究结果表明,本研究获得的CaIL29-ELP、ELP-CaIFNα和ELP-CaIFNαγ融合干扰素具有较高的纯度和较强的抗病毒活性,并可能有较长的体内半衰期,有望用于犬病毒病的治疗。
【关键词】：犬干扰素 类弹性蛋白多肽 融合表达 分离纯化 抗病毒活性
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;S858.292
【目录】：

• 摘要2-4
• ABSTRACT4-6
• 符号说明6-10
• 综述一：犬干扰素的研究进展10-14
• 1. 干扰素的研究进展10-14
• 1.1 干扰素的分类10
• 1.2 干扰素的生物学特性及应用10-12
• 1.3 基因工程干扰素研究进展12
• 1.4 犬干扰素的研究进展12-14
• 综述二：重组蛋白标签的研究进展14-17
• 1. 融合标签14-16
• 2. ELP标签的应用16-17
• 研究内容一：类弹性蛋白多肽融合犬白介素29的表达与活性检测17-34
• 1. 材料17-19
• 1.1 生物材料和主要试剂17-18
• 1.2 主要仪器设备18
• 1.3 培养基和常用溶液18-19
• 2 实验方法19-28
• 2.1 基因克隆19-22
• 2.2 表达载体构建22-23
• 2.3 重组蛋白的诱导表达23-24
• 2.4 重组蛋白表达条件优化24-26
• 2.5 融合干扰素活性检测26-28
• 3 结果28-33
• 3.1 基因扩增28-29
• 3.2 pCaIL29-ELP构建29
• 3.3 融合蛋白表达29-31
• 3.4 相变循环参数优化31-32
• 3.5 融合蛋白纯化32
• 3.6 融合蛋白的活性测定32-33
• 4 讨论33-34
• 研究内容二：类弹性蛋白多肽融合犬α干扰素的表达与活性检测34-43
• 1 材料34-35
• 1.1 菌株、细胞、病毒34
• 1.2 主要工具酶与试剂34
• 1.3 培养基和常用溶液34
• 1.4 主要仪器34-35
• 2 实验方法35-39
• 2.1 基因克隆35-36
• 2.2 表达载体构建36-38
• 2.3 重组蛋白诱导表达38
• 2.4 表达产物分析38
• 2.5 表达条件优化38
• 2.6 融合蛋白纯化38
• 2.7 干扰素活性测定38-39
• 3 结果39-42
• 3.1 融合表达载体构建39
• 3.2 融合蛋白表达分析39-40
• 3.3 融合蛋白表达条件优化40-41
• 3.4 沉淀ELP-CaIFN α 1的盐浓度41
• 3.5 ELP-CaIFN α 1融合蛋白的纯化41-42
• 3.6 干扰素的活性测定42
• 4 讨论42-43
• 研究内容三：ELP-CaIFN α-CaIFN γ的融合表达与抗病毒活性检测43-50
• 1 材料43-44
• 1.1 生物材料43
• 1.2 工具酶与试剂43
• 1.3 培养基和常用溶液43
• 1.4 主要仪器43-44
• 2 实验方法44-47
• 2.1 表达载体构建44-46
• 2.2 重组蛋白诱导表达46
• 2.3 诱导表达条件优化46
• 2.4 表达条件优化46
• 2.5 融合蛋白纯化46
• 2.6 干扰素活性测定46-47
• 3 结果47-49
• 3.1 表达载体构建47
• 3.2 融合蛋白表达分析47-48
• 3.3 相变循环盐浓度优化48
• 3.4 融合蛋白纯化48-49
• 3.5 融合干扰素的活性测定49
• 4 讨论与总结49-50
• 全文总结50-51
• 参考文献51-56
• 致谢56-57

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1 王璋瑜;;蛋白设计实验室公司买下融合蛋白技术实用权[J];生物技术通报;1990年10期

2 张毅,屈贤铭,杨胜利;融合蛋白基因工程应用及研究[J];生物工程进展;2000年03期

3 杨林,李国清,黄葆英,王全忠,龙綮新,王s阏，

本文编号：458444