鉴别PRRS野毒株与TJM-F92疫苗株间接ELISA方法的建立与初步应用

发布时间：2017-06-18 10:01

  本文关键词：鉴别PRRS野毒株与TJM-F92疫苗株间接ELISA方法的建立与初步应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状并造成免疫抑制的病毒性传染病,尤其是在2006年高致病性猪繁殖与呼吸综合征(highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome,HP-PRRS)大范围爆发和流行,给我国养猪业造成巨大的损失。目前我国主要依靠接种疫苗和执行严格生物安全措施进行PRRS的防控,而中长期防治PRRS需进一步的净化猪群。高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TJM-F92疫苗株(HP-PRRSV TJM-F92)是HP-PRRSV TJ株在细胞上连续传代至92代所得弱毒疫苗株。TJM-F92的非结构蛋白2(non-structural protein2,Nsp2)存在一段连续的120个氨基酸缺失。本研究利用表达TJM-F92疫苗株Nsp2蛋白上连续缺失的120个氨基酸的原核表达质粒GST-Nsp2-d120表达蛋白GST-d120,并将纯化的GST-d120蛋白作为包被抗原,建立并优化了鉴别诊断PRRSV野毒感染和弱毒活疫苗TJM-F92免疫动物的间接酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法,命名为d120-ELISA。建立d120-ELISA后,采用受试者工作曲线方法对270份血清的OD值进行分析,确定d120-ELISA的阴阳性临界S/P值为0.25。当S/P值为0.25时,d120-ELISA的敏感性为90.7%,特异性为95.1%;d120-ELISA检测其他常见猪病阳性血清的结果表明其具有PRRS特异性;重复性试验结果显示变异系数在0.77~17.02%;以上结果表明d120-ELISA具有良好的特异性、敏感性、重复性。与商品化试剂盒对比结果显示,检测野毒感染或其他弱毒活疫苗免疫阳性血清的符合率为90.7%,检测PRRSV阴性血清的符合率为92.2%,商品化试剂盒检测为阳性的TJM-F92或灭活疫苗免疫血清,d120-ELISA检测全为阴性,表明d120-ELISA能够区分PRRSV野毒感染与弱毒活疫苗TJM-F92免疫动物。为进一步验证鉴别d120-ELISA方法能够区分野毒感染与弱毒活疫苗TJM-F92免疫动物,本研究通过采集10头试验动物210份血清进行血清动力学试验,同时采集具有明确免疫背景的150份临床血清进行鉴别d120-ELISA方法的临床初步应用。血清动力学试验和临床血清检测结果均表明d120-ELISA检测阳性抗体时间晚于IDEXX 10 d左右,但d10-ELISA方法可以鉴别出IDEXX试剂盒无法鉴别的免疫弱毒活疫苗TJM-F92或免疫灭活疫苗猪群中发生野毒感染的动物。综上所述,本实验建立了具有良好敏感性、特异性和重复性的鉴别PRRSV野毒感染和弱毒活疫苗TJM-F92免疫动物的d120-ELISA方法,检测试验动物血清和临床血清结果表明d120-ELISA方法可以区分野毒感染和弱毒活疫苗TJM-F92免疫的动物。本研究为组装d120-ELISA试剂盒,鉴别弱毒活疫苗TJM-F92免疫猪群中野毒感染阳性动物,促进猪场的净化奠定了基础。
【关键词】：猪繁殖与呼吸综合征 TJM-F92 Nsp2 间接ELISA 鉴别野毒感染与疫苗接种
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-12
• 英文缩略表12-13
• 第一章 引言13-20
• 1.1 病原学与流行病学13-14
• 1.1.1 PRRSV的病原学13-14
• 1.1.2 流行病学14
• 1.2 PRRSV主要非结构蛋白的功能14-16
• 1.3 PRRSV实验室检测方法研究进展16-17
• 1.4 PRRS的综合防控17-19
• 1.4.1 影响PRRSV传播的主要因素17-18
• 1.4.2 PRRS的防控18-19
• 1.5 本研究的目的及意义19-20
• 第二章 弱毒疫苗株TJM-F92 Nsp2缺失120个氨基酸重组蛋白的表达20-25
• 2.1 实验材料20
• 2.1.1 质粒和血清20
• 2.1.2 主要试剂和仪器20
• 2.2 方法20-22
• 2.2.1 GST-d120蛋白的表达20-21
• 2.2.2 GST-d120蛋白的纯化21
• 2.2.3 SDS-PAGE与Western blot鉴定纯化蛋白21-22
• 2.2.4 纯化蛋白浓度的测定22
• 2.3 结果与分析22-23
• 2.3.1 纯化GST-d120蛋白的SDS-PAGE与Western blot分析鉴定22-23
• 2.3.2 纯化蛋白浓度测定结果23
• 2.4 讨论23-25
• 第三章 鉴别PRRSV野毒感染和疫苗免疫间接ELISA方法的建立25-41
• 3.1 材料25
• 3.1.1 血清样品25
• 3.1.2 主要试剂和仪器25
• 3.2 方法25-29
• 3.2.1 方阵法确定蛋白最佳包被浓度及血清稀释度25-26
• 3.2.2 最佳抗原包被液和包被条件的优化26
• 3.2.3 最佳封闭液和封闭条件的优化26
• 3.2.4 最佳血清稀释液和作用时间的优化26-27
• 3.2.5 最佳酶标二抗稀释液、工作浓度和作用时间的优化27
• 3.2.6 最佳TMB作用时间的优化27
• 3.2.7 d120-ELISA方法临界值的确定27-28
• 3.2.8 d120-ELISA特异性试验28
• 3.2.9 d120-ELISA方法的敏感性28
• 3.2.10 d120-ELISA重复性试验28
• 3.2.11 与IDEXX PRRSV X3试剂盒的对比性分析28-29
• 3.3 结果与分析29-39
• 3.3.1 蛋白最佳包被浓度及血清稀释度的确定29-30
• 3.3.2 最佳抗原包被液和包被条件的确定30-31
• 3.3.3 最佳封闭液和封闭条件的确定31-32
• 3.3.4 最佳血清稀释液和作用时间的确定32-33
• 3.3.5 最佳酶标二抗稀释液、工作浓度和作用时间的确定33-35
• 3.3.6 最佳TMB作用时间的确定35
• 3.3.7 d120-ELISA方法最终反应条件的确定35
• 3.3.8 d120-ELISA方法临界值的确定35-36
• 3.3.9 d120-ELISA特异性分析36-37
• 3.3.10 d120-ELISA的敏感性试验37
• 3.3.11 d120-ELISA的重复性结果37-39
• 3.3.12 与IDEXX PRRSV X3试剂盒的对比性结果39
• 3.4 讨论39-41
• 第四章 血清动力学实验和鉴别d120-ELISA的临床应用41-48
• 4.1 材料和方法41-43
• 4.1.1 主要试剂及仪器41
• 4.1.2 GST-d120血清动力学试验41-42
• 4.1.3 临床血清采集试验设计42
• 4.1.4 样品OD值检测与阴阳性的判定42-43
• 4.2 结果与分析43-46
• 4.2.1 GST-d120蛋白血清动力学试验结果与分析43-44
• 4.2.2 临床血清检测结果与分析44-46
• 4.3 讨论46-48
• 第五章 结论48-49
• 参考文献49-56
• 附录56-61
• 致谢61-62
• 作者简介62

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