永生化山羊卵泡颗粒细胞系的建立及凋亡诱导因子对其凋亡的作用

发布时间：2017-06-22 06:08

  本文关键词：永生化山羊卵泡颗粒细胞系的建立及凋亡诱导因子对其凋亡的作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在雌性哺乳动物体内,储存了数以万计的原始卵泡,但仅有很少一部分可以被选择并排卵。大多数卵泡会走向闭锁,这是卵泡生长发育过程中的一个正常的生理学现象。目前认为卵巢卵泡闭锁的主要原因是颗粒细胞的凋亡,但是颗粒细胞凋亡的分子机制并不是很清楚。凋亡诱导因子(AIF)介导不依赖caspase的凋亡通路,会引起染色质的浓缩和片段化。但是AIF在颗粒细胞凋亡中的作用并不完全清楚。虽然利用原代卵泡颗粒细胞可以对颗粒细胞的凋亡等方面进行研究,但是无法长期体外培养会限制一些研究的进行。本研究通过向颗粒细胞转染hTERT基因的表达载体,筛选出具有永生化的山羊卵泡颗粒细胞系,以该细胞系为研究对象,探索AIF在颗粒细胞凋亡中的作用。(1)卵泡穿刺法获取山羊卵泡颗粒细胞,转染pCI-neo-hTERT,用G418筛选获得阳性克隆细胞,将阳性细胞连续传代培养,已培养至50代,命名为hTERT-GGCs。应用PCR和免疫荧光方法,检测证实hTERT基因在hTERT-GGCs中稳定表达。逆转录PCR检测表明甾体类激素合成通路中相关酶StAR(576bp)、CYP11A1(233bp)、CYP19A1(547bp)、CYP17A1(146bp)和促性腺素受体LHR(270bp)、ERα(846bp)、ERβ(634bp)的表达与GGCs无显著差异。GGCs和hTERT-GGCs孕酮分泌量差异不显著。hTERT-GGCs具有正常的核型,增值活力比GGCs旺盛,端粒长度稳定,没有致瘤性。(2)免疫组化和Western Blot检测发现,AIF主要在闭锁卵泡中固缩的细胞和分散的颗粒细胞层中表达,并随着卵泡闭锁程度的增加表达量升高;卵泡直径的增大AIF基因表达量增强。根据山羊AIF基因设计干扰序列,构建了慢病毒干扰载体,证明降低AIF基因表达水平,可以减少由于血清饥饿诱导的颗粒细胞凋亡。综上所述,本研究建立了永生化的山羊卵泡颗粒细胞系。降低AIF基因表达水平可以减少由于血清饥饿诱导的颗粒细胞凋亡。
【关键词】：山羊 颗粒细胞 永生化 凋亡诱导因子 凋亡
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S827
【目录】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-12
• 文献综述12-24
• 第一章 卵泡颗粒细胞与细胞永生化研究进展12-21
• 1.1 卵泡颗粒细胞12-14
• 1.1.1 颗粒细胞在卵泡发育中的作用12-13
• 1.1.2 颗粒细胞的分泌功能13-14
• 1.2 卵泡颗粒细胞凋亡14-16
• 1.2.1 雌激素14
• 1.2.2 胰岛素样生长因子(IGF)14
• 1.2.3 消耗细胞生长因子引起的凋亡14-15
• 1.2.4 FAS配合基和FAS系统15
• 1.2.5 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)15-16
• 1.2.6 BCL2家族成员(线粒体介导的凋亡)16
• 1.3 端粒与端粒酶16-17
• 1.3.1 端粒的结构与功能16-17
• 1.3.2 端粒酶的结构与功能17
• 1.4 细胞永生化17-21
• 1.4.1 细胞衰老17-18
• 1.4.2 细胞危机18
• 1.4.3 细胞永生化的方法18-19
• 1.4.4 端粒酶对细胞永生化的作用与优势19-21
• 第二章 凋亡诱导因子研究进展21-24
• 2.1 凋亡诱导因子的研究概况21-22
• 2.1.1 AIF在细胞程序性死亡中的作用21-22
• 2.1.2 AIF在凋亡细胞中致死作用的调控22
• 2.2 凋亡细胞中线粒体释放AIF的调控22-23
• 2.3 凋亡诱导因子在细胞存活、增殖和新陈代谢中的作用23-24
• 试验研究24-56
• 第三章 永生化山羊卵泡颗粒细胞系的建立24-41
• 3.1 材料24
• 3.1.1 主要仪器24
• 3.1.2 主要试剂24
• 3.2 方法24-30
• 3.2.1 山羊卵巢的采集24
• 3.2.2 卵泡颗粒细胞的分离与培养24-25
• 3.2.3 pCI-neo-hTERT转染山羊卵泡颗粒细胞25-26
• 3.2.4 hTERT-GGCs生物学鉴定26-30
• 3.3 结果30-38
• 3.3.1 山羊卵泡颗粒细胞的分离培养30-31
• 3.3.2 pCI-neo-hTERT的鉴定31
• 3.3.3 新霉素(G418)最佳筛选浓度确定31-32
• 3.3.4 阳性细胞扩大培养32
• 3.3.5 hTERT-GGCs形态学观察32
• 3.3.6 hTERT基因表达鉴定32-34
• 3.3.7 检测甾体类激素合成相关基因的表达34
• 3.3.8 hTERT-GGCs增值活力和细胞周期检测34-35
• 3.3.9 hTERT-GGCs甾体类激素合成水平的检测35-37
• 3.3.10 软琼脂试验37
• 3.3.11 hTERT-GGCs核型分析37-38
• 3.3.12 hTERT-GGCs端粒长度检测38
• 3.4 讨论38-39
• 3.5 小结39-41
• 第四章 凋亡诱导因子在山羊卵泡颗粒细胞凋亡中的作用41-56
• 4.1 材料41
• 4.1.1 主要仪器41
• 4.1.2 主要试剂41
• 4.1.3 实验中涉及的细胞41
• 4.2 方法41-48
• 4.2.1 山羊卵巢组织包埋、切片41-42
• 4.2.2 免疫组织化学定位AIF42
• 4.2.3 山羊有腔卵泡的剥离和颗粒细胞的收集42
• 4.2.4 细胞全蛋白的提取42-43
• 4.2.5 Western Blot分析43
• 4.2.6 山羊AIF基因shRNA慢病毒载体构建43-46
• 4.2.7 慢病毒的包装46-48
• 4.3 结果48-54
• 4.3.1 AIF在山羊卵巢的定位48
• 4.3.2 AIF在颗粒细胞的表达水平48-49
• 4.3.3 慢病毒干扰载体PCR鉴定49-50
• 4.3.4 慢病毒包装质粒鉴定50-51
• 4.3.5 慢病毒包装与滴度检测51-52
• 4.3.6 有效干扰片段的筛选52-53
• 4.3.7 AIFshRNA对hTERT-GGCs饥饿诱导的凋亡的影响53-54
• 4.4 讨论54-55
• 4.5 小结55-56
• 结论56-57
• 参考文献57-68
• 缩略词68-69
• 致谢69-70
• 作者简介70

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 胡成钰;鳙鱼(Aristichthys nobilis)外周血细胞的细微结构[J];江西科学;1990年03期

2 王妍;赵晓娥;杨培先;张仕强;苏利红;马保华;;小鼠卵巢颗粒细胞的体外培养[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);2007年08期

3 梁刚;叶效林;任耀辉;;乌梢蛇卵泡不同发育期颗粒细胞的显微结构变化[J];动物学杂志;2009年01期

4 杨永梅;陈娟;陈洋;姜怀志;;小鼠卵巢颗粒细胞的优化培养[J];中国畜牧兽医;2011年02期

5 阎萍;郭宪;许保增;杨博辉;;牦牛输卵管上皮细胞和卵泡颗粒细胞的培养[J];畜牧与兽医;2005年10期

6 朱建辉，，黄夺先，李朝军，赵伟;Epostane对小鼠颗粒细胞孕酮、睾酮合成的影响[J];江苏农业学报;1995年03期

7 高庆华,蒋超祥,韩春梅;FSH和胰岛素对牛卵泡颗粒细胞长期培养的影响[J];中国草食动物;2004年04期

8 高庆华;周虚;王春清;韩春梅;叶云鹏;;促卵泡激素和胰岛素对牛卵泡颗粒细胞长期培养的影响[J];中国兽医学报;2006年04期

9 张滕子;王春生;李晶;宁方勇;朴善花;安铁洙;;拟蜘蛛拖丝蛋白基因在小鼠颗粒细胞中的整合及其鉴定[J];黑龙江畜牧兽医;2011年07期

10 刘岩;姜小龙;陈建伟;孟金柱;黄洋;吕丽华;;胰岛素对体外培养猪卵巢卵泡颗粒细胞生长及增殖的影响[J];畜牧兽医科技信息;2014年02期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 杨雪;周从容;;胰岛素样生长因子Ⅱ对人颗粒细胞分泌功奶的影响[A];第二届西部地区（12省区）妇产科学术会议论文汇编[C];2006年

2 沈健;冯云;龙雯晴;喇端端;;颗粒细胞水平抑制素B的表达及其在女性生殖中的意义[A];首届沪浙妇产科学术论坛暨2006年浙江省妇产科学学术年会论文汇编[C];2006年

3 丁婷;罗爱月;杨书红;赖志文;卢运萍;马丁;王世宣;;小鼠卵巢颗粒细胞不同分离方法的比较[A];中华医学会第三次全国绝经学术会议暨绝经相关问题学习班论文汇编[C];2011年

4 翁静;诸定寿;;小鼠卵周围颗粒细胞排卵后在输卵管内死亡过程的研究[A];第九次全国生殖生物学学术研讨会论文摘要集[C];2003年

5 沈浣;;颗粒细胞与卵母细胞发育[A];中华医学会第六次全国生殖医学学术会议专刊[C];2012年

6 王春生;李晶;张滕子;宁方勇;朴善花;安铁洙;;拟蜘蛛丝蛋白基因在小鼠颗粒细胞中的整合及其鉴定[A];中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十六次学术研讨会论文集[C];2010年

7 甄t熑

本文编号：470898