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永生化山羊卵泡颗粒细胞系的建立及凋亡诱导因子对其凋亡的作用

发布时间:2017-06-22 06:08

  本文关键词:永生化山羊卵泡颗粒细胞系的建立及凋亡诱导因子对其凋亡的作用,由笔耕文化传播整理发布。


【摘要】:在雌性哺乳动物体内,储存了数以万计的原始卵泡,但仅有很少一部分可以被选择并排卵。大多数卵泡会走向闭锁,这是卵泡生长发育过程中的一个正常的生理学现象。目前认为卵巢卵泡闭锁的主要原因是颗粒细胞的凋亡,但是颗粒细胞凋亡的分子机制并不是很清楚。凋亡诱导因子(AIF)介导不依赖caspase的凋亡通路,会引起染色质的浓缩和片段化。但是AIF在颗粒细胞凋亡中的作用并不完全清楚。虽然利用原代卵泡颗粒细胞可以对颗粒细胞的凋亡等方面进行研究,但是无法长期体外培养会限制一些研究的进行。本研究通过向颗粒细胞转染hTERT基因的表达载体,筛选出具有永生化的山羊卵泡颗粒细胞系,以该细胞系为研究对象,探索AIF在颗粒细胞凋亡中的作用。(1)卵泡穿刺法获取山羊卵泡颗粒细胞,转染pCI-neo-hTERT,用G418筛选获得阳性克隆细胞,将阳性细胞连续传代培养,已培养至50代,命名为hTERT-GGCs。应用PCR和免疫荧光方法,检测证实hTERT基因在hTERT-GGCs中稳定表达。逆转录PCR检测表明甾体类激素合成通路中相关酶StAR(576bp)、CYP11A1(233bp)、CYP19A1(547bp)、CYP17A1(146bp)和促性腺素受体LHR(270bp)、ERα(846bp)、ERβ(634bp)的表达与GGCs无显著差异。GGCs和hTERT-GGCs孕酮分泌量差异不显著。hTERT-GGCs具有正常的核型,增值活力比GGCs旺盛,端粒长度稳定,没有致瘤性。(2)免疫组化和Western Blot检测发现,AIF主要在闭锁卵泡中固缩的细胞和分散的颗粒细胞层中表达,并随着卵泡闭锁程度的增加表达量升高;卵泡直径的增大AIF基因表达量增强。根据山羊AIF基因设计干扰序列,构建了慢病毒干扰载体,证明降低AIF基因表达水平,可以减少由于血清饥饿诱导的颗粒细胞凋亡。综上所述,本研究建立了永生化的山羊卵泡颗粒细胞系。降低AIF基因表达水平可以减少由于血清饥饿诱导的颗粒细胞凋亡。
【关键词】:山羊 颗粒细胞 永生化 凋亡诱导因子 凋亡
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S827
【目录】:
  • 摘要6-7
  • ABSTRACT7-12
  • 文献综述12-24
  • 第一章 卵泡颗粒细胞与细胞永生化研究进展12-21
  • 1.1 卵泡颗粒细胞12-14
  • 1.1.1 颗粒细胞在卵泡发育中的作用12-13
  • 1.1.2 颗粒细胞的分泌功能13-14
  • 1.2 卵泡颗粒细胞凋亡14-16
  • 1.2.1 雌激素14
  • 1.2.2 胰岛素样生长因子(IGF)14
  • 1.2.3 消耗细胞生长因子引起的凋亡14-15
  • 1.2.4 FAS配合基和FAS系统15
  • 1.2.5 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)15-16
  • 1.2.6 BCL2家族成员(线粒体介导的凋亡)16
  • 1.3 端粒与端粒酶16-17
  • 1.3.1 端粒的结构与功能16-17
  • 1.3.2 端粒酶的结构与功能17
  • 1.4 细胞永生化17-21
  • 1.4.1 细胞衰老17-18
  • 1.4.2 细胞危机18
  • 1.4.3 细胞永生化的方法18-19
  • 1.4.4 端粒酶对细胞永生化的作用与优势19-21
  • 第二章 凋亡诱导因子研究进展21-24
  • 2.1 凋亡诱导因子的研究概况21-22
  • 2.1.1 AIF在细胞程序性死亡中的作用21-22
  • 2.1.2 AIF在凋亡细胞中致死作用的调控22
  • 2.2 凋亡细胞中线粒体释放AIF的调控22-23
  • 2.3 凋亡诱导因子在细胞存活、增殖和新陈代谢中的作用23-24
  • 试验研究24-56
  • 第三章 永生化山羊卵泡颗粒细胞系的建立24-41
  • 3.1 材料24
  • 3.1.1 主要仪器24
  • 3.1.2 主要试剂24
  • 3.2 方法24-30
  • 3.2.1 山羊卵巢的采集24
  • 3.2.2 卵泡颗粒细胞的分离与培养24-25
  • 3.2.3 pCI-neo-hTERT转染山羊卵泡颗粒细胞25-26
  • 3.2.4 hTERT-GGCs生物学鉴定26-30
  • 3.3 结果30-38
  • 3.3.1 山羊卵泡颗粒细胞的分离培养30-31
  • 3.3.2 pCI-neo-hTERT的鉴定31
  • 3.3.3 新霉素(G418)最佳筛选浓度确定31-32
  • 3.3.4 阳性细胞扩大培养32
  • 3.3.5 hTERT-GGCs形态学观察32
  • 3.3.6 hTERT基因表达鉴定32-34
  • 3.3.7 检测甾体类激素合成相关基因的表达34
  • 3.3.8 hTERT-GGCs增值活力和细胞周期检测34-35
  • 3.3.9 hTERT-GGCs甾体类激素合成水平的检测35-37
  • 3.3.10 软琼脂试验37
  • 3.3.11 hTERT-GGCs核型分析37-38
  • 3.3.12 hTERT-GGCs端粒长度检测38
  • 3.4 讨论38-39
  • 3.5 小结39-41
  • 第四章 凋亡诱导因子在山羊卵泡颗粒细胞凋亡中的作用41-56
  • 4.1 材料41
  • 4.1.1 主要仪器41
  • 4.1.2 主要试剂41
  • 4.1.3 实验中涉及的细胞41
  • 4.2 方法41-48
  • 4.2.1 山羊卵巢组织包埋、切片41-42
  • 4.2.2 免疫组织化学定位AIF42
  • 4.2.3 山羊有腔卵泡的剥离和颗粒细胞的收集42
  • 4.2.4 细胞全蛋白的提取42-43
  • 4.2.5 Western Blot分析43
  • 4.2.6 山羊AIF基因shRNA慢病毒载体构建43-46
  • 4.2.7 慢病毒的包装46-48
  • 4.3 结果48-54
  • 4.3.1 AIF在山羊卵巢的定位48
  • 4.3.2 AIF在颗粒细胞的表达水平48-49
  • 4.3.3 慢病毒干扰载体PCR鉴定49-50
  • 4.3.4 慢病毒包装质粒鉴定50-51
  • 4.3.5 慢病毒包装与滴度检测51-52
  • 4.3.6 有效干扰片段的筛选52-53
  • 4.3.7 AIFshRNA对hTERT-GGCs饥饿诱导的凋亡的影响53-54
  • 4.4 讨论54-55
  • 4.5 小结55-56
  • 结论56-57
  • 参考文献57-68
  • 缩略词68-69
  • 致谢69-70
  • 作者简介70

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