禽戊型肝炎病毒衣壳蛋白在乳酸乳球菌中的表达及其免疫保护作用与机理

发布时间：2017-06-24 14:07

  本文关键词：禽戊型肝炎病毒衣壳蛋白在乳酸乳球菌中的表达及其免疫保护作用与机理，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：禽戊型肝炎病毒(avian Hepatitis virus,a HEV)是一种可以引起肝脾肿大综合征的肝炎病毒,a HEV与人HEV(hHEV)、猪HEV(sHEV)同属于肝炎病毒属,为无囊膜单股正链RNA病毒,基因组全长6.6 kb,包含2个非编码区和3个开放阅读框(ORFs)。系统发育进化树分析显示,aHEV不同于hHEV、s HEV,在分类上为第五基因型。aHEV与hHEV具有抗原相关性,可作为研究hHEV复制和发病机制的有效模型。aHEV主要通过粪-口途径传播,可以感染30-72周龄的蛋鸡和肉种鸡使其产蛋率下降和死淘率升高,发病鸡通常腹部充血,卵巢退化,肝脏脂肪或淀粉样变性,肝脾肿大。目前,该病尚无临床可用的商业化疫苗。本研究探索了a HEV ORF2蛋白在乳酸乳球菌中的表达,评估了重组乳酸乳球菌经口服免疫后对aHEV感染的免疫保护作用,试验内容与结构简述如下:将aHEV ORF2基因克隆入原核表达载体pET30a(+)中构建pET30a(+)-ORF2,阳性质粒转化入大肠杆菌感受态细胞中,筛选获得重组阳性菌;经IPTG诱导后,对目的蛋白的表达进行检测。以纯化的ORF2蛋白免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。将aHEV ORF2主要抗原片段(△ORF2)克隆入乳酸菌表达载pTX8048中,筛选获得三种阳性质粒pTX8048-△ORF2、pTX8048-SP-△ORF2-CWA和pTX8048-SP-△ORF2,电转化入受体菌L.lactis NZ9000中获得三种重组阳性乳酸乳球菌(L.lactis/pTX8048-△ORF2、L.lactis/pTX8048-SP-△ORF2-CWA、L.lactis/pTX8048-SP-△ORF2)。Western-blot检测Nisin诱导后阳性菌内目的蛋白的表达。结果表明,ORF2在大肠杆菌中表达蛋白大小为72 kDa;制备的多克隆抗体效价达216,Western-blot证实制备多抗具有良好的反应性。阳性乳酸菌经Nisin诱导后,Western-blot成功检测到菌体内、菌体表面及菌体分泌蛋白大小分别为56 kDa、67 kDa、54 kDa。将诱导后5×109 CFU的三种重组菌及携带空载体质粒的重组菌(空载体组)经口服免疫雏鸡。免疫后采用ELISA方法对免疫鸡血清中抗ORF2蛋白特异性抗体IgG和小肠洗液和胆汁中特异性sIg A水平进行检测。应用实时荧光定量PCR对免疫后鸡肝脏和脾脏中IL-2和IFN-γmRNA相对表达量进行检测。结果表明,免疫后鸡血清中IgG抗体、鸡小肠洗液和胆汁中sIg A随免疫次数增加而呈上升趋势,且均与空载体组、PBS组有极显著差异(p0.01)。三次免疫后,三种表达目的蛋白的重组乳酸菌免疫组肝脏、脾脏IL-2、IFN-γmRNA相对表达量均显著或极显著高于PBS组、空载体组(p0.05或p0.01)。三次免疫后经翅静脉接种aHEV病毒悬液。应用实时荧光定量PCR对感染后鸡粪便排毒量、病毒血症进行了绝对定量。对感染后各组不同日龄鸡的肝脏中乳酸脱氢酶(LDH)含量进行了检测。结果表明,三种重组阳性乳酸菌免疫组鸡粪便中和血清中病毒载量显著或极显著低于空载体组(p0.05或p0.01)。感染后7天,空载体组鸡血清中LDH极显著高于三种重组菌免疫组及PBS组(p0.01)。对感染后各组鸡进行剖检,从病理学角度评估三种重组阳性乳酸菌对病毒感染所致病理损伤的免疫保护作用。结果表明,病毒侵害靶器官主要为肝脏和脾脏,且随着攻毒后鸡日龄增加,病理损伤逐渐加重;感染后21天,空载体组鸡肝脏和脾脏体积明显肿大,而三种重组乳酸菌免疫组鸡的肝脏和脾脏未见明显肿大;感染后28天,空载体组鸡肝脏和脾脏可见局部淤血,点状出血,空泡状病变区域,而三种重组乳酸菌免疫组眼观病理变化相对轻微。病理组织学观察,可见空载体组鸡肝脏组织内炎性细胞局灶性浸润,肝细胞空泡变性、坏死、崩解。脾脏白髓内大量红细胞,局域性纤维素渗出;白髓内散在分布、伊红淡染坏死灶,主要为变性和坏死的淋巴细胞、网状细胞和巨噬细胞。三种重组乳酸菌免疫组鸡的肝脏和脾脏病理组织学变化相对轻微。综上所述,本研究将为禽戊型肝炎疫苗研制及a HEV致病性的进一步研究提供重要参考。
【关键词】：禽戊型肝炎病毒 ORF2 乳酸乳球菌 免疫保护
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要9-11
• 英文摘要11-14
• 1 引言14-22
• 1.1 戊型肝炎病毒研究进展14-16
• 1.1.1 戊型肝炎病毒研究概述14
• 1.1.2 戊型肝炎病毒的形态特征和理化特性14
• 1.1.3 戊型肝炎病毒的基因组结构14-15
• 1.1.4 戊型肝炎病毒基因分型15-16
• 1.1.5 戊型肝炎流行特征及诊断16
• 1.2 禽戊型肝炎病毒的研究进展16-18
• 1.2.1 禽戊型肝炎病毒的概述16-17
• 1.2.2 禽戊型肝炎病毒的传播17
• 1.2.3 禽戊型肝炎病毒的复制位点及致病性17
• 1.2.4 禽戊型肝炎病毒衣壳蛋白抗原表位的鉴定17-18
• 1.2.5 禽戊型肝炎病毒人兽共患性的研究18
• 1.3 乳酸菌作为口服疫苗传递载体的研究进展18-21
• 1.3.1 乳酸菌的益生作用18-19
• 1.3.2 乳酸菌对机体免疫的影响19
• 1.3.3 乳酸菌表达系统的研究进展19-21
• 1.4 研究目的与意义21-22
• 2 材料与方法22-39
• 2.1 试验材料22-26
• 2.1.1 质粒、菌种和病毒22
• 2.1.2 试验动物22
• 2.1.3 引物合成22
• 2.1.4 培养基及抗生素的配制22-23
• 2.1.5 主要试剂23
• 2.1.6 主要仪器与设备23
• 2.1.7 间接ELISA相关试剂配制23-25
• 2.1.8 SDS-PAGE及Western-blot溶液配制25-26
• 2.1.9 其他溶液的配制26
• 2.2 实验方法26-39
• 2.2.1 a HEV ORF2基因在大肠杆菌中的诱导表达26-30
• 2.2.2 兔抗a HEV ORF2蛋白多克隆抗体制备30-32
• 2.2.3 a HEV △ORF2蛋白在乳酸乳球菌中的诱导表达32-34
• 2.2.4 实验动物分组及取材34-35
• 2.2.5 病毒的增殖及定量35-36
• 2.2.6 免疫后IgG和IgA抗体效价变化36
• 2.2.7 免疫后肝脏、脾脏IL-2、IFN-γ mRNA表达变化36-37
• 2.2.8 攻毒后血清病毒血症检测37
• 2.2.9 攻毒后的粪便排毒检测37
• 2.2.10 攻毒后血清中乳酸脱氢酶（LDH）的检测37-38
• 2.2.11 肝脏、脾脏病理学观察38-39
• 3 结果39-57
• 3.1 a HEV ORF2在大肠杆菌中表达39-40
• 3.1.1 重组质粒pET-30a-ORF2构建与鉴定39-40
• 3.1.2 重组ORF2在大肠杆菌中诱导表达40
• 3.2 兔抗a HEV ORF2多克隆抗体的制备40-41
• 3.2.1 间接ELISA方法检测多克隆抗体效价40
• 3.2.2 Western-blot检测多克隆抗体反应性40-41
• 3.3 a HEV△ORF2在乳酸乳球菌中表达41-44
• 3.3.1 重组质粒的PCR及酶切鉴定41
• 3.3.2 a HEV △ORF2蛋白Western-blot鉴定41-44
• 3.4 表达a HEV △ORF2蛋白重组乳酸乳球菌免疫保护作用44-57
• 3.4.1 免疫后各组鸡抗体效价44-46
• 3.4.2 免疫后肝脏、脾脏IL-2、IFN-γ mRNA表达量变化46-48
• 3.4.3 病毒定量用标准曲线的绘制48-49
• 3.4.4 攻毒后各组鸡病毒血症检测49
• 3.4.5 攻毒后各组鸡粪便排毒检测49-51
• 3.4.6 攻毒后各组鸡血清中乳酸脱氢酶（LDH）的检测51
• 3.4.7 攻毒后各组鸡肝脏、脾脏病理学变化51-57
• 4 讨论57-61
• 4.1 a HEV ORF2相关研究57
• 4.2 a HEV ORF2蛋白在乳酸菌中的表达57-58
• 4.3 重组乳酸乳球菌抗感染免疫保护作用58-61
• 4.3.1 免疫后抗体效价的变化58
• 4.3.2 免疫后肝脏、脾脏IL-2、IFN-γ mRNA表达变化58-59
• 4.3.3 攻毒后病理损伤变化59-61
• 5 结论61-62
• 致谢62-63
• 参考文献63-68
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文68

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