东方巴贝斯虫顶质体基因组的测序分析及RON2在入侵中作用的研究

发布时间：2017-06-24 18:16

  本文关键词：东方巴贝斯虫顶质体基因组的测序分析及RON2在入侵中作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：东方巴贝斯虫(Babesia orientalis)是牛的巴贝斯虫病中比较特殊的一个血液原虫虫种,其仅感染水牛的红细胞,由镰形扇头蜱经卵传播。在我国长江以南多省份均有流行,患病动物常出现黄疸、高热、贫血和血红蛋白尿等症状,严重时甚至死亡,对我国的水牛养殖业造成巨大的经济损失。现阶段对于东方巴贝斯虫的基因组信息所知有限,入侵相关机制的研究也鲜有报道。基于此,本研究一方面克隆并注释了东方巴贝斯虫的顶质体基因组DNA序列,并对其总体的结构特征进行了详细的比对分析;另一方面,钓取了东方巴贝斯虫棒状体颈部蛋白2(RON2)基因信息,对RON2与AMA1的相互作用进行了初步研究。(1)B.orientalis顶质体基因组的测序分析对于顶质体基因组,根据基因组测序的高通量测序序列和cDNA文库钓取的部分顶质体DNA序列,结合NCBI公布的顶复门血液原虫顶质体DNA序列,选择其保守区设计引物,克隆东方巴贝斯虫顶质体DNA全长。测序结果用软件进行拼接,Artemis做注释。结果表明,东方巴贝斯虫顶质体基因组全长33200bp的环状分子,AT含量在78.9%,包含1个核糖体大亚基(LSU)、1个核糖体小亚基(SSU),38个编码蛋白的开放读码框以及24个转运RNA(tRNA)。其中38个ORF包括4个DNA依赖的RNA合成酶小亚基(rpoB、rpoC1、rpoC2a、rpoC2b)、17个核糖体蛋白、1个翻译延长因子(tufA)、2个Clp分子伴侣基因以及14个大小功能未知的假定蛋白。进一步对所获得的东方巴贝斯虫顶质体基因组DNA与NCBI上有报道的相关顶复门寄生虫作了详细的比对分析,综合的结果表明东方巴贝斯虫顶质体基因组从基因组大小,基因种类,基因结构,基因排列顺序,基因进化分析等一系列特征上都与牛巴贝斯虫的顶质体最为接近。(2)棒状体颈部蛋白RON2和AMA1基因的相互作用根据NCBI上公布的顶复门寄生虫的RON2序列及部分假定蛋白序列和东方巴贝斯虫基因组测序获得的部分序列,设计引物克隆东方巴贝斯虫棒状体颈部蛋白2(RON2)基因,获得的测序结果全长为4035bp,本研究选取了RON2与AMA1有相互作用的功能域进行截短表达,分别设计特异性引物克隆BoRON2-2、BoRON2-5,构建GST标签原核表达质粒pGEX-KG-RON2-2、pGEX-KG-RON2-5,高效表达。用纯化后的RON2-2、RON2-5重组蛋白进行Far-western实验,以及和AMA1蛋白的粘附ELISA实验。结果表明,重组表达的RON2-2及RON2-5与东方巴贝斯虫全虫抗原中的AMA1之间存在相互作用,并且二者之间的相互作用以一定的比例进行粘附。
【关键词】：东方巴贝斯虫 顶质体基因组 测序分析 RON2 蛋白表达 相互作用
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 缩略语表10-12
• 第一章 文献综述12-22
• 1.1 顶复门寄生虫顶质体研究进展12-18
• 1.1.1 引言12
• 1.1.2 顶质体的发现12-13
• 1.1.3 顶质体的来源13-14
• 1.1.4 顶质体的结构14
• 1.1.5 顶质体的基因组14-15
• 1.1.6 顶质体的生物学功能15-17
• 1.1.7 顶质体的生物学意义17-18
• 1.2 顶复门寄生虫移动连接体相关分子的研究进展18-22
• 1.2.1 顶膜抗原 1（AMA1）19-20
• 1.2.2 棒状体颈部蛋白（RONs）20-22
• 第二章 东方巴贝斯虫顶质体基因组测序分析22-37
• 2.1 研究目的意义22-23
• 2.2 材料与方法23-29
• 2.2.1 虫株和试验动物23
• 2.2.2 菌种与质粒23-24
• 2.2.3 主要仪器与试剂24
• 2.2.4 东方巴贝斯虫的纯化24
• 2.2.5 DNA模板的的提取24
• 2.2.6 顶质体基因组的扩增24-26
• 2.2.7 PCR反应体系26
• 2.2.8 PCR产物的回收纯化及连接26-27
• 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备27
• 2.2.10 连接产物的转化27
• 2.2.11 碱裂解法小量提取质粒27-28
• 2.2.12 质粒的酶切鉴定28
• 2.2.13 东方巴贝斯虫顶质体基因的确定28
• 2.2.14 生物信息学分析网站及软件28-29
• 2.3 结果分析29-35
• 2.3.1 顶质体基因组片段的筛选29-30
• 2.3.2 顶质体基因组的克隆分析30-35
• 2.3.2.1 顶质体基因组的序列30-31
• 2.3.2.2 顶质体基因组的注释31
• 2.3.2.3 顶质体基因组的基本特性31-32
• 2.3.2.4 顶质体基因组的分段比对32-34
• 2.3.2.5 顶质体基因组的系统进化分析34-35
• 2.4 讨论35-37
• 第三章 东方巴贝斯虫RON2在入侵中作用的研究37-59
• 3.1 研究目的与意义37
• 3.2 材料与方法37-46
• 3.2.1 菌株、血清、载体及蛋白37-38
• 3.2.2 主要仪器与试剂38-39
• 3.2.3 主要溶液的配制39-41
• 3.2.4 水牛红细胞膜蛋白的获取41
• 3.2.5 东方巴贝斯虫裂殖子全抗原的提取41
• 3.2.6 棒状体颈部蛋白RON2基因的克隆与测序41-42
• 3.2.7 RON2重组表达质粒的构建42
• 3.2.8 RON2重组蛋白的原核表达42
• 3.2.9 RON2重组蛋白的纯化提取42-43
• 3.2.10 Far-western bloting43
• 3.2.11 AMA1多克隆抗体血清IgG的纯化43-44
• 3.2.12 生物素标记AMA1多克隆抗体血清IgG的试验44-45
• 3.2.13 AMA与RON2的粘附ELISA试验45-46
• 3.3 结果与分析46-57
• 3.3.1 BoRON2基因的序列扩增及测定46-48
• 3.3.2 BoRON2基因序列的生物信息学分析48-49
• 3.3.3 RON2短肽段原核表达质粒的构建49-50
• 3.3.4 短肽段重组蛋白的诱导表达50-51
• 3.3.5 重组蛋白的纯化51-52
• 3.3.6 Far-western结果52-54
• 3.3.7 顶膜抗原AMA1多抗血清IgG的纯化及生物素标记54-55
• 3.3.8 AMA1多抗血清标记生物素后IgG效价的测定55
• 3.3.9 AMA1与RON2粘附ELISA试验55-57
• 3.4 讨论57-59
• 3.4.1 棒状体颈部蛋白RON2的基因克隆与截短表达57
• 3.4.2 RON2与AMA1蛋白相互作用的验证57-59
• 4 结论59-60
• 参考文献60-70
• 致谢70-72
• 附录72

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 赵俊龙;刘钟灵;姚宝安;马丽华;;4℃保存的红细胞对东方巴贝斯虫体外培养的影响[J];中国农业大学学报;1998年S2期

2 赵俊龙,刘钟灵,姚宝安,马丽华,刘恩勇,丁明星,张德明,任宪武,彭伏虎,钟龙群;东方巴贝斯虫分泌性抗原的免疫保护作用研究[J];畜牧兽医学报;2000年02期

3 赵俊龙,刘钟灵,姚宝安,马丽华;东方巴贝斯虫体外培养的研究4℃保存的红细胞对东方巴贝斯虫体外培养的影响[J];华中农业大学学报;1998年06期

4 刘琴,付媛,周艳琴,周丹娜,江涛,王金苹,赵俊龙,姚宝安;东方巴贝斯虫的18S rRNA基因的扩增及系统发育研究[J];畜牧兽医学报;2005年09期

5 何德肆;徐平源;陈文承;李芬;胡涛;彭运潮;刘毅;;边缘无浆体SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J];中国兽医科学;2011年03期

6 ;[J];;年期

中国重要会议论文全文数据库 前3条

1 张颖;周艳琴;姚宝安;赵俊龙;;东方巴贝斯虫线粒体基因的测序与细胞色素b基因的研究[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会论文集[C];2009年

2 刘琴;付媛;周艳琴;周丹娜;江涛;王金苹;赵俊龙;姚宝安;;东方巴贝斯虫的分子生物学分类研究[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第五次代表大会暨第八次学术研讨会论文集[C];2004年

3 张颖;周艳琴;姚宝安;赵俊龙;;东方巴贝斯虫线粒体基因的测序与细胞色素b基因的研究[A];中国奶业协会第24次繁殖学术年会暨国家奶牛/肉牛产业技术体系第一届全国牛病防治学术研讨会论文集[C];2009年

中国博士学位论文全文数据库 前4条

1 贺兰;东方巴贝斯虫新型诊断方法的建立和基因组序列测定与分析[D];华中农业大学;2011年

2 周丹娜;东方巴贝斯虫免疫相关蛋白的基因克隆及功能研究[D];华中农业大学;2009年

3 刘琴;东方巴贝斯虫cDNA文库构建及其应用[D];华中农业大学;2007年

4 Muhammad Kasib Khan;[D];华中农业大学;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前6条

1 余倩;东方巴贝斯虫热休克蛋白20基因克隆表达及功能研究[D];华中农业大学;2013年

2 黄源;东方巴贝斯虫顶质体基因组的测序分析及RON2在入侵中作用的研究[D];华中农业大学;2016年

3 张庆丽;牛红细胞表面受体糖蛋白和东方巴贝斯虫球状体蛋白3基因的克隆表达及分析[D];华中农业大学;2012年

4 范丽哲;东方巴贝斯虫3个免疫相关基因的克隆表达[D];华中农业大学;2014年

5 张文杰;东方巴贝斯虫棒状体相关蛋白1（RAP1）基因克隆及免疫特性研究[D];华中农业大学;2012年

6 张颖;东方巴贝斯虫EST序列分析及其线粒体基因的测定[D];华中农业大学;2009年

  本文关键词：东方巴贝斯虫顶质体基因组的测序分析及RON2在入侵中作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：479055