硒对绵羊精原干细胞体外增殖与凋亡的影响

发布时间：2017-06-25 13:06

  本文关键词：硒对绵羊精原干细胞体外增殖与凋亡的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本研究通过在绵羊精原干细胞(Spermatogonial Stem Cells, SSCs)培养体系中添加不同浓度的硒,一方面为建立绵羊SSCs体外培养体系提供理论依据,另一方面探究硒对绵羊SSCs体外增殖与凋亡的影响,以期为体外研究硒对精子发生过程的影响奠定基础。选取4-6月龄晋中当地绵羊作为试验对象,采用两步酶消化法并利用Percoll密度梯度分离和差异贴壁相结合的方法对绵羊SSCs进行纯化。试验共分5个组,分别向培养体系中添加不同浓度硒(0、2、4、8、16pmol/L),每个浓度设置5个重复,每隔48 h换液。绵羊SSCs接种到0.2%明胶预处理的24孔板和96孔板中培养。培养96 h,采用PLZF鉴定SSCs,以确定SSCs是否处于未分化状态;测定SSCs细胞活力、凋亡情况以及不同时间段不同硒浓度下SSCs内超氧自由基(ROS)水平变化情况;采用qRT-PCR和Western blotting技术分别检测细胞周期基因(CyclinB1、CDK1、p21、p27)和凋亡相关基因(p53、Bax、 Bcl-2、Caspase3/8) mRNA和蛋白的表达量。其试验结果及分析如下：(1)经鉴定,绵羊SSCs主要位于19%-35% Percoll梯度层中,采用差异贴壁法对其进一步纯化,SSCs纯度可达80%。(2)在绵羊SSCs的培养体系中添加不同浓度的硒,研究硒对绵羊SSCs生长状况的影响。培养96 h,用PLZF对其进行鉴定,发现大多数SSCs处于未分化状态;在不同硒处理组中SCCs均有不同程度的葡萄样增殖;硒浓度为2μmol/L时,细胞活率、增殖率显著高于其他处理组(P0.05)：在硒处理组中,SSCs的细胞活率和增殖率随着硒浓度的升高而降低,凋亡率随着硒浓度的升高而增大。(3)研究硒对绵羊SSCs内ROS水平的影响。通过测定不同时间段(48 h、96 h)不同处理组SSCs内ROS变化情况,结果发现：在不同时间段,硒浓度为2μmol/L时,ROS水平最低,硒浓度16μmol/L时,ROS水平最高;在同一时间段不同硒处理组中,ROS水平随着硒浓度的升高而升高；在不同时间段同一硒浓度中,随着时间的延长,ROS水平逐渐升高。(4)进一步从分子水平上探究硒对绵羊SSCs体外增殖与凋亡的影响。经qRT-RCR和Western blotting检测分析,结果发现：在硒处理组中,CyclinB1、CDK1、Bcl-2 mRNA表达量随着硒浓度的升高而升高,而p53、p21、p27和Bax、Caspase3/8的mRNA表达量随着浓度的升高而降低。当硒浓度为2μmol/L时,CyclinB1和Bcl-2 mRNA表达量显著高于其他组(P0.05),p53、Bax和Caspase3/8 mRNA表达量显著低于其它硒处理组(P0.05),但CDK1、p21和p27 mRNA表达量与4μmol/L组差异不显著(P0.05);细胞周期关键蛋白(P53、P21、P27、CDK1、Bax)的表达趋势和mRNA表达量基本一致。在绵羊SSCs体外培养体系中添加适宜浓度的硒能够促进SSCs的增殖,相反,过量的硒则会抑制SSCs增殖或者促进凋亡,且本研究得出硒较适宜的添加量为2μmol/L;硒可能是通过改变绵羊SSCs内ROS水平和调节细胞周期和凋亡相关的关键调节分子的表达影响绵羊SSCs体外增殖与凋亡。
【关键词】：硒 精原干细胞 增殖 凋亡 绵羊
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S826.5
【目录】：

• 摘要8-10
• 前言10-11
• 文献综述11-22
• 1 精原干细胞与精子发生11-12
• 1.1 精原干细胞概念及其来源11
• 1.2 精子发生11-12
• 2 精原干细胞的生物学特性12-15
• 2.1 精原干细胞形态及其在曲精细管中的分布12-13
• 2.2 精原干细胞的凋亡13-14
• 2.3 精原干细胞表面分子标记14-15
• 3 精原干细胞的分离纯化与体外培养影响因素15-19
• 3.1 精原干细胞的分离纯化15-17
• 3.1.1 精原干细胞的分离方法16
• 3.1.2 精原干细胞的纯化方法16-17
• 3.2 精原干细胞体外培养的影响因素17-19
• 3.2.1 温度18
• 3.2.2 基础培养基18
• 3.2.3 饲养层18-19
• 3.2.4 清19
• 3.2.5 生长因子19
• 4 硒对精子发生的作用19-21
• 4.1 微量元素硒的简介19-20
• 4.2 硒的抗氧化作用20
• 4.3 硒与精子发生20-21
• 5 本研究意义21-22
• 材料与方法22-32
• 1 试验材料22-24
• 1.1 试验动物22
• 1.2 主要试剂22
• 1.3 溶液配置22-23
• 1.4 主要仪器设备23-24
• 2 试验方法24-30
• 2.1 样品采集24
• 2.2 绵羊睾丸切片制作24
• 2.3 H-E染色24
• 2.4 免疫荧光24-25
• 2.5 绵羊精原干细胞的分离25
• 2.6 绵羊精原干细胞的纯化25
• 2.7 绵羊精原干细胞纯度的计算25-26
• 2.8 绵羊精原干细胞计数26
• 2.9 绵羊精原干细胞的培养26
• 2.10 培养96h绵羊精原干细胞的鉴定26-27
• 2.11 绵羊精原干细胞细胞增殖的检测27
• 2.12 氧自由基(ROS)检测27
• 2.13 绵羊精原干细胞的收集27
• 2.14 绵羊精原干细胞活率、凋亡率检测27
• 2.15 绵羊精原干细胞凋亡染色27-28
• 2.16 细胞周期和细胞凋亡关键基因mRNA水平的检测28-30
• 2.16.1 引物设计28
• 2.16.2 精原干细胞总RNA提取28-29
• 2.16.3 总RNA质量的鉴定29
• 2.16.4 cDNA的合成29
• 2.16.5 qRT-PCR29-30
• 2.17 细胞周期和凋亡关键蛋白检测30
• 3 数据处理与统计分析30-32
• 结果与分析32-48
• 1 绵羊睾丸组织形态观察及PLZF染色效果32
• 2 绵羊精原干细胞的分离32-34
• 3 差异贴壁纯化前后绵羊精原干细胞纯度的比较34
• 4 硒对绵羊精原干细胞体外生长的影响34-35
• 5 培养96h后绵羊精原干细胞PLZF鉴定结果35-37
• 6 硒对绵羊精原干细胞细胞活力、凋亡的影响37-38
• 7 硒对绵羊精原干细胞增殖的影响38-39
• 8 硒对氧自由基(ROS)水平的影响39-40
• 9 不同硒浓度下绵羊精原干细胞凋亡染色结果40-41
• 10 硒对绵羊精原干细胞周期和凋亡相关基因表达的影响41-46
• 10.1 内参基因18S和细胞周期及凋亡基因的扩增曲线及熔解曲线41-43
• 10.2 不同处理组绵羊精原干细胞内P21、P27、CyclinB1、CDK1 mRNA的表达差异43-45
• 10.3 不同处理组绵羊精原干细胞内P53、Bax、Bcl-2、Caspase3/8 mRNA的表达差异45-46
• 11 硒对细胞周期和凋亡关键蛋白表达水平的影响46-48
• 讨论48-52
• 结论52-53
• 参考文献53-60
• 附录 在读期间研究成果及获奖情况60-62
• Abstract62-64
• 致谢64

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张仕强;毕聪明;彭树英;吕宁;张涌;;不同培养条件对牛精原干细胞增殖的影响与特性鉴定[J];畜牧兽医学报;2007年06期

2 张学明,李莲军,李德雪,赖良学,潘耀谦;哺乳动物精原干细胞研究进展[J];动物医学进展;2002年01期

3 张学明,李晶,李莲军,罗秉坤,李德雪;哺乳类精原干细胞体外培养影响因素[J];动物医学进展;2002年05期

4 李莲军,卢克焕;哺乳动物精原干细胞及其生物学特性[J];广西农业生物科学;2004年04期

5 张学明,李德雪,岳占碰;精原干细胞的体外增殖与分化(英文)[J];中国农学通报;2005年05期

6 成钢,冯书堂,牟玉莲,岳文斌;哺乳动物精原干细胞体外培养研究进展[J];中国畜牧兽医;2005年10期

7 孙淼;朱宝长;;精原干细胞的生命历程[J];生物技术通报;2005年06期

8 李莲军,卢晟盛,黎宗强,杨小淦,卢克焕;精原干细胞更新分化的影响因素[J];云南农业大学学报;2005年01期

9 毕聪明;张仕强;彭树英;李吉霞;张涌;;牛精原干细胞的分离和纯化及体外培养的一般特性[J];畜牧兽医学报;2006年10期

10 孙思宇;魏彩霞;李碧春;;精原干细胞体外培养及影响因素[J];中国畜牧杂志;2007年05期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 吴侠;吴应积;罗奋华;于海泉;旭日干;;大鼠精原干细胞的分离及体外培养的研究[A];第十届全国生殖生物学学术研讨会论文摘要集[C];2005年

2 徐富翠;胡红梅;吴绍华;;精原干细胞在成骨培养条件下生物学特征的研究[A];2007年中国解剖学会第十届全国组织学与胚胎学青年学术研讨会论文摘要汇编[C];2007年

3 余荣娇;徐斯凡;曾辛;杨俊玲;;表皮生长因子在精原干细胞增殖中的作用及其机制研究[A];中国生理学会2004年消化内分泌生殖学术研讨会论文摘要汇编[C];2004年

4 毕聪明;张仕强;彭树英;吕宁;张涌;;牛精原干细胞体外长时间存活增殖及鉴定[A];全国兽医外科学第13次学术研讨会、小动物医学第1次学术研讨会暨奶牛疾病第3次学术讨论会论文集[C];2006年

5 采克俊;丁海雷;丁志丽;张易祥;张念慈;刘莉;;鸡精原干细胞分离与体外培养的初步研究[A];中国细胞生物学学会第九次会员代表大会暨青年学术大会论文摘要集[C];2007年

6 陈云波;张易祥;张念慈;采克俊;刘莉;;白消安去除公鸡精原干细胞的研究[A];中国细胞生物学学会第九次会员代表大会暨青年学术大会论文摘要集[C];2007年

7 张茨;刘春霞;王玲珑;杨嗣星;胡云飞;;采用流式细胞术分离精原干细胞的实验研究[A];中华医学会第八次全国男科学学术会议论文集[C];2007年

8 陶科;涂炯炯;范立青;朱文兵;孙源;卢光t;;鼠精原干细胞培养体系的建立及与人精原干细胞培养体系的比较[A];第一届中华医学会生殖医学分会、中国动物学会生殖生物学分会联合年会论文汇编[C];2007年

9 唐立新;范双喜;文任乾;江芳;徐姗姗;邓顺美;马春杰;唐运革;;大鼠精原干细胞的分离纯化[A];第一届中华医学会生殖医学分会、中国动物学会生殖生物学分会联合年会论文汇编[C];2007年

10 胡建新;何坚;;精原干细胞体外技术的进展[A];2007年贵州省医学会泌尿外科分会学术年会论文汇编[C];2007年

中国重要报纸全文数据库 前5条

1 记者 李晶晶;海南成功培育猴类精原干细胞[N];海口晚报;2013年

2 高原;吸烟可破坏精原干细胞[N];医药经济报;2007年

3 ;美成功用鼠精原干细胞培育出幼鼠[N];中国中医药报;2004年

4 刘海英;美科学家发现精原干细胞有望替代医用胚胎干细胞[N];科技日报;2009年

5 高原;吸烟损害精子质量[N];人民日报;2007年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 萨初拉;牛精原干细胞分离纯化及长期培养研究[D];内蒙古大学;2013年

2 王菊花;山羊精原干细胞体外增殖及其分化的调控[D];安徽农业大学;2014年

3 赵会敏;巴马小型猪精原干细胞相关问题的研究[D];广西大学;2014年

4 阿拉达尔;山羊精原干细胞体外培养体系的建立与移植研究[D];西北农林科技大学;2007年

5 罗小敏;小鼠精原干细胞体内增殖和分化阶段睾丸组织基因的差异表达[D];武汉大学;2010年

6 张岩;大鼠精原干细胞的长期培养、鉴定及其特异标记基因表达载体的构建[D];内蒙古大学;2011年

7 刘陶迪;大鼠青春期前期精原干细胞自我更新和分化相关基因表达的初步研究[D];内蒙古大学;2012年

8 张学明;小鼠精原干细胞培养体系的优化及体外基因转移[D];吉林大学;2005年

9 李恩中;精原干细胞的体外培养及自增殖相关因子的筛选与初步研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2007年

10 张世庆;精原干细胞自增殖分子机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2007年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 凡志国;小鼠精原干细胞体外培养与冷冻技术研究[D];西北农林科技大学;2011年

2 穆海龙;PLZF通过靶向抑制miR-146a促进CXCR4表达调控奶山羊精原干细胞增殖[D];西北农林科技大学;2015年

3 蔡桓;牛精原干细胞的分离培养和组蛋白H3K9三甲基化修饰研究[D];吉林大学;2016年

4 吴崇洋;白藜芦醇对小鼠精原干细胞生物学特性的影响[D];西北农林科技大学;2016年

5 牛博文;褪黑素通过刺激支持细胞分泌GDNF促进奶山羊精原干细胞的增殖[D];西北农林科技大学;2016年

6 姬敏;小鼠睾丸3D培养体系的建立与成年小鼠精原干细胞富集方法的研究[D];内蒙古大学;2016年

7 田洪成;小鼠精原干细胞新特异性标记物的确定[D];宁夏医科大学;2016年

8 姚晓磊;硒对绵羊精原干细胞体外增殖与凋亡的影响[D];山西农业大学;2016年

9 班文赞;树

本文编号：482195