shRNA-DCN调控鸭肌肉生长发育的分子机制研究

发布时间：2017-07-04 15:27

  本文关键词：shRNA-DCN调控鸭肌肉生长发育的分子机制研究

  更多相关文章： Decorin 鸭 成肌细胞 shRNA

【摘要】：核心蛋白聚糖(Decorin)是存在于细胞外基质中的硫酸软骨素蛋白聚糖家族的一员,在肌肉细胞分化、迁移和调节结缔组织形成的过程中发挥着重要的作用。肌肉的生长发育与蛋白代谢过程密切相关,多种细胞信号转导通路参与了肌肉蛋白代谢过程。哺乳动物中的研究表明,Decorin是TGF-β的胞外配体,可通过该信号通路影响细胞的分化和转移。DCN通过抑制MSTN来促进细胞的增殖和分化,还能够通过抑制IGF1 R的活性、激活AKT等调控肌肉的生长发育。在鸭中,DCN是否可通过TGF-β/Smad和IGF1/P13K/AKTIMTOR通路来实现对肌肉生长发育的调控过程,目前还不明确。因此,本研究通过构建DCN基因的干扰载体,分别将其转染至鸭成肌细胞及雏鸭腿肌中,同时采用PI3K基因的激活剂重组人胰岛素样生长因子□(Recombinant human insulin-like growth factors□, RH IGF1)处理鸭成肌细胞。通过用CCK-8法检测细胞的活性,用组织石蜡切片法观察肌肉的生长发育状态,分别用qRT-PCR法和ELISA法检测TGF-β/Smad和IGF1/PI3K/AKT/MTOR信号通路中基因的表达量,以期得到沉默DCN基因在细胞和个体水平上对鸭肌肉生长发育的调控及其途径。主要试验结果如下：(1)构建了鸭DCN基因干扰载体shRNA1、shRNA2、shRNA3和阴性对照载体shControl。转染至鸭成肌细胞后,成功筛选出干扰效果较好的载体shRNA3和最佳转染时间24h。qRT-PCR和ELISA检测结果显示,在鸭成肌细胞和雏鸭腿肌中转染该干扰载体可使DCN得到抑制。鸭DCN基因的shRNA最佳干扰序列为5’CGCAGACACCAACATTACTAG3’。(2)分别用shRNA-DCN和shControl处理鸭成肌细胞,培养24h后用qRT-PCR和ELISA法检测相关基因和蛋白的表达量。结果显示shRNA-DCN处理组与shControl处理组相比,成肌细胞的活性明显下降,且IGF1 R、PI3K、AKT、MTOR、 p70S6K、MYOD、TGF-β R1和Smad4基因以及Decorin、P13K、MTOR、TGF-β R1和Smad2蛋白表达量显著降低(P0.05)。表明沉默DCN基因可通过IGF1/PI3K/IAKTIMTOR/p70S6K信号通路和TGF-β/Smad信号通路抑制鸭成肌细胞的增殖。(3)用shRNA-DCN处理鸭成肌细胞,同时向培养液中添加RH IGF1 (20ng/mL),培养24小时后用qRT-PCR和ELISA法检测相关基因和蛋白的表达量。结果发现,与shRNA-DCN处理组相比,shRNA-DCN+IGF1处理组中成肌细胞的活性明显增加,且GF1 R、AKT、 MTOR、p70S6K和Smad4基因以及Decorin、PI3K、MTOR、 TGF-βR1和Smad2蛋白的表达量显著升高(p0.05)。表明RH IGF1可通过IGF1/PI3K/AKT/MTOR/p70S6K信号通路和TGF-β/Smad信号通路缓解DCN基因沉默对成肌细胞增殖活性的抑制。(4)在雏鸭腿肌中沉默DCN基因后,使IGF1/PI3K/AKT/MTOR/p70S6K信号通路和TGF-β/Smad信号通路中IGF1R、MTOR、S6K、TGFβR1和Smad4等基因的表达水平降低,但并未导致肌纤维直径和密度发生显著变化,推测这可能与个体生长发育过程中自我修复的调控机制有关。
【关键词】：Decorin 鸭 成肌细胞 shRNA
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S834
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 常用词语英文缩写9-12
• 前言12
• 1 文献综述12-23
• 1.1 DCN的结构与功能12-15
• 1.1.1 DCN的结构13
• 1.1.2 DCN的生物学功能13-15
• 1.2 肌肉的生长发育及其调控通路15-20
• 1.3 Decorin对肌肉生长发育的调控作用20-22
• 1.4 研究的目的意义22-23
• 2 材料与方法23-31
• 2.1 试验材料23
• 2.1.1 试验样品处理及采集23
• 2.1.2 试剂耗材23
• 2.2 试验方法23-31
• 2.2.1 DCN基因干扰载体的构建24
• 2.2.2 质粒的扩繁及提取24-25
• 2.2.3 荧光定量引物的设计与合成25-26
• 2.2.4 成肌细胞的培养26-28
• 2.2.5 CCK-8法检测细胞的活性28
• 2.2.6 shRNA处理雏鸭及样品的采集28-29
• 2.2.7 总RNA的提取及cDNA的合成29-30
• 2.2.8 实时荧光定量PCR检测30-31
• 2.2.9 ELISA法检测蛋白含量31
• 3 结果与分析31-43
• 3.1 构建干扰载体31-32
• 3.2 shRNA-DCN对成肌细胞的影响32-39
• 3.2.1 DCN基因干扰载体的筛选32-34
• 3.2.2 PI3K激活剂RH IGF1处理成肌细胞时间点分析34
• 3.2.3 shRNA-DCND对成肌细胞增殖的调控分析34-38
• 3.2.4 RH IGF1缓解shRNA-DCN的抑制作用38-39
• 3.3 沉默DCN基因对鸭腿肌的影响39-43
• 3.3.1 转染时间点的筛选39-40
• 3.3.2 shRNA-DCN对相关基因表达的影响40
• 3.3.3 shRNA-DCN对腿肌发育的影响40-43
• 4 讨论43-48
• 4.1 DCN对成肌细胞增殖和分化的影响43-44
• 4.2 DCN调控成肌细胞增殖和分化的信号通路44-46
• 4.3 肌肉生长发育过程中IGF1与DCN的关系46
• 4.4 DCN对肌肉生长发育的影响46-48
• 5 结论48-49
• 参考文献49-57
• 致谢57-58
• 硕士研究生学习期间发表文章58

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