ZEA、DON及其联合染毒诱导CTLL-2细胞凋亡及信号途径研究

发布时间：2017-07-08 18:18

  本文关键词：ZEA、DON及其联合染毒诱导CTLL-2细胞凋亡及信号途径研究

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【摘要】：脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol, DON)和玉米赤霉烯酮(Z earalenone, ZEA)是饲料中两种最常见的霉菌毒素。ZEA和DON可降低饲料的营养价值,导致动物生长性能和繁殖性能下降,还具有免疫抑制作用,可导致畜禽对疫病的抵抗力大大下降。目前,人们并没有完全搞清ZEA和DON免疫毒性作用及其机理。另外,自然情况下,ZEA和DON在饲料中的常共同存在,研究它们对畜禽造成的联合免疫毒性作用及其机理对ZEA和DON中毒的防控更具有指导意义,特别是可以为饲料中这两种霉菌毒素限量标准的制定提供依据。为揭示ZEA和DON及其联合作用的免疫毒性和分子机理,本研究以CTLL-2细胞(细胞毒性T淋巴细胞株)为材料,进行了不同浓度的ZEA、DON及联合染毒试验,利用CCK-8法、酶联免疫吸附法、流式细胞术和免疫印迹法等技术检测了细胞毒性、免疫相关细胞因子分泌、细胞凋亡率及凋亡相关信号蛋白表达等变化情况。1.DON、ZEA对CTLL-2细胞毒性作用及联合染毒浓度确定。用不同浓度的ZEA(0、2.5、5、10、20、40μg/mL)、DON (0、0.25、0.5、1、2、4μg/mL)处理CTLL-2细胞48h。用CCK-8法检测不同浓度的DON、ZE A对CTLL-2细胞的细胞活力的影响。结果表明,随着ZEA、DON浓度的升高,CTLL-2细胞的细胞活力下降,与对照组相比,0.25μg/mL DON染毒组差异不显著,0.5μg/mL及以上DON染毒组差异极显著(P0.01)；与对照组相比,ZEA染毒组均有显著性差异或极显著性差异(P0.05或P0.01)；与对照组相比,0.25μg/mL DON+2.5μg/mL ZEA及以上联合染毒组细胞活力下降(P0.01)。根据CCK-8法检测结果并参考相关文献,设定0.5 μg/mL DON+5 μg/mL ZEA为ZEA、DON联合染毒浓度。2.ZEA、DON及其联合染毒对CTLL-2细胞PFP等相关细胞因子分泌的影响。用不同浓度的ZEA (0、5、10、20μg/mL)、DON (0、0.5、1、2μg/mL)及联合(空白组、5μg/mL ZEA、0.5μg/mL DON、5μg/mL ZEA 和 0.5μg/mL DON)处理CTLL-2细胞48h。用酶联免疫吸附法检测细胞内及培养上清液中颗粒酶B(GZMB)、穿孔素(PFP)、干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的浓度。结果表明,ZEA、DON能够抑制CTLL-2细胞胞内及培养上清液中PFP、GZMB、IFN-y的表达,呈剂量-效应关系：随着ZEA、DON浓度的升高,细胞胞内及培养上清液中的TNF-a浓度表达量也逐渐升高,呈剂量-效应关系；ZEA、 DON联合染毒表现为协同效应。3.ZEA、DON及其联合染毒对CTLL-2细胞凋亡的影响。用不同浓度的ZEA(0、5、10、20μg/mL)、DON (0、0.5、1、2μg/mL)及联合(空白组、5μg/mL ZEA、0.5μg/mL DON、5μg/mL ZEA和0.5 μg/mL DON)处理CTLL-2细胞48 h,用流式细胞术检测细胞凋亡率的影响；20 μg/mL的ZEA和2μg/mL的DON分别处理CTLL-2细胞48h, DAPI染色法观察细胞核形态学的变化。结果表明,随着ZEA、DON浓度的增加,CTLL-2细胞的凋亡率呈上升趋势,较对照组有显著或极显著差异(P0.05或P0.01),ZEA和DON联合染毒为协同效应；DAPI染色结果显示,ZEA、DON处理组部分细胞有凋亡的细胞核形态特征,如细胞核体积缩小,染色质凝聚,核固缩成新月体,部分细胞核呈碎块状致密荧光。4.ZEA、DON及其联合染毒诱导CTLL-2细胞凋亡通路的研究。用不同浓度的ZEA(0、5、10、20μg/mL)、DON (0、0.5、1、2μg/mL)及联合(空白组、5 μg/mL ZEA、0.5 μg/mL DON、5 μg/mL ZEA和0.5 μ/mL DON)处理CTLL-2细胞48 h。用免疫印记法检测细胞凋亡相关通路蛋白的表达情况,流式细胞术检测ZEA、DON与FasL中和抗体共处理后细胞凋亡率。结果表明,各染毒组p53蛋白表达量较对照组有显著性或极显著差异(P0.05或P0.01);随着ZEA、DON浓度的升高,Bax/Bcl-2的比值升高,呈剂量-效应关系,ZEA与DON联合染毒表现为协同效应。ZEA、DON促进细胞色素c从线粒体中释放到胞浆中,能够上调Cleaved-Caspase 9、Cleaved-Caspase 3的表达,均较对照组有显著性或极显著差异(P0.05或P0.01)；FasL、Fas、Cleaved-Caspase8蛋白表达量随着ZEA、DON浓度的升高逐渐增加,均较对照组有显著性或极显著差异(P0.05或P0.01),与ZEA、DON处理组相比,FasL中和抗体与ZEA、DON共同处理组细胞凋亡率明显下降(P0.01);随着ZEA、DON浓度的升高,p38 MAPK、JNK、Erk的磷酸化水平也升高,呈剂量-效应关系；ZEA与DON联合染毒组,与对照组相比,Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 8、 Cleaved-Caspase 9蛋白的表达量均上升,呈极显著差异(P0.01),相比较ZEA、DON单独染毒组,ZEA、DON联合染毒为协同效应。结论,ZEA、DON对CTLL-2细胞有毒性作用,可以抑制CTLL-2细胞的增殖,ZEA、DON可以抑制C TLL-2细胞有关细胞因子的表达,降低CTLL-2细胞杀伤活力。ZEA、DON可以诱导CTLL-2细胞发生凋亡,激活CTLL-2细胞线粒体通路、MAPKs通路,ZEA、DON通过死亡受体途径诱导CTLL-2细胞凋亡。ZEA、DON联合染毒表现为协同效应。
【关键词】：玉米赤霉烯酮 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 细胞因子 CTLL-2细胞 凋亡通路
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S859.8
【目录】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 缩略语表10-11
• 上篇 文献综述11-22
• 1 玉米赤霉烯酮研究进展11-14
• 2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇研究进展14-17
• 3 DON与ZEA联合毒性作用研究进展17-18
• 4 细胞毒性T细胞的免疫功能研究进展18-20
• 5 研究目的和意义20-22
• 下篇 实验部分22-64
• 第一章 DON、ZEA对CTLL-2细胞的毒性作用及联合染毒浓度确定22-27
• 1 材料与方法22-24
• 2 结果24-25
• 3 讨论25-27
• 第二章 ZEA、DON及其联合染毒对CTLL-2细胞PFP等细胞因子分泌的影响27-39
• 1 材料与方法27-30
• 2 结果30-37
• 3 讨论37-39
• 第三章 ZEA、DON及其联合染毒对CTLL-2细胞凋亡的影响39-46
• 1 材料与方法39-41
• 2 结果41-44
• 3 讨论44-46
• 第四章 ZEA、DON及其联合染毒诱导CTLL-2细胞凋亡通路的研究46-64
• 1 材料与方法46-49
• 2 结果49-60
• 3 讨论60-64
• 结论64-65
• 参考文献65-71
• 致谢71-72
• 攻读学位期间发表论文、论著72-73

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1 潘顺叶;ZEA、DON及其联合染毒诱导CTLL-2细胞凋亡及信号途径研究[D];扬州大学;2016年

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本文编号：535770