狐、貉、貂源伪狂犬病毒分离鉴定及gC基因表达

发布时间：2017-07-14 03:04

  本文关键词：狐、貉、貂源伪狂犬病毒分离鉴定及gC基因表达

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【摘要】：伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的一种多种动物共患的烈性传染病。其临床症状主要表现为发热、奇痒、呼吸困难、母畜不孕、流产、死胎等。自2011年末疑似PR在我国辽宁、河北、山东等地的毛皮动物中大量出现,造成了严重的经济损失。为了探寻病原学依据,从患病狐、貉、貂脑组织病料中分离到Fox1、Rac1、Mink1等多株PRV,并对其生物学特性进行了系统研究。发现分离毒株接种MDCK细胞均呈现出疱疹病毒特征的细胞病变。通过电镜,可观察到100~180 nm带有囊膜的病毒粒子。攻毒家兔和小白鼠均表现出典型的PR症状,并从脑组织中再次检测到PRV gB基因,证明分离病毒为PRV。进一步对Fox1、Rac1和Mink1株的生物学特性进行研究,发现其在MDCK细胞上的TCID50可达10-7.83/mL~10-7.5/mL,对氯仿和胰酶敏感,在pH5~pH9的环境中稳定,对热具有较强的耐受性。测定Rac1对小鼠的LD50为10-4.8/mL。通过分子流行病学分析发现本试验获得的狐、貉、貂源毒株与CLW2014-1株、TJ株、ZJ01株等近年来分离的猪源变异强毒株亲缘关系最近。并且在Rac1株gE蛋白48位、497位和gC蛋白63~69位,观察到了变异毒株特有的3处标志性插入。表明造成此次狐、貉、貂PR流行的毒株并非疫苗株或国内早期流行毒株,而极有可能是近年来新出现的PRV变异株,这为我国狐、貉、貂PR的防控提供了参考和依据。设计特异性引物,扩增PRV Rac1株gC基因膜外区,克隆至原核表达载体pET-32a的T7启动子下游和pGEX-6p-1的Tac启动子下游,构建gC-His和gC-Gst重组表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,经Western blot鉴定成功获得目的蛋白,表达产物分子量大小分别为70 kDa和76 kDa。表明成功表达gC膜外区蛋白,为进一步的免疫学研究,新型诊断和治疗方法的建立奠定了基础。
【关键词】：狐 貉 貂 伪狂犬病毒 gC基因
【学位授予单位】：河北科技师范学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 缩略词4-5
• 摘要5-6
• ABSTRACT6-9
• 第一章 绪论9-22
• 1.1 伪狂犬病毒9-18
• 1.1.1 PRV的结构特点9-14
• 1.1.2 PRV增殖循环14-16
• 1.1.3 免疫逃避机制16
• 1.1.4 潜伏感染16-18
• 1.1.5 抑制细胞凋亡18
• 1.2 狐、貉、貂PR18-19
• 1.3 疫苗和检测方法19-21
• 1.4 本研究的目的和意义21-22
• 第二章 材料与方法22-34
• 2.1 主要试剂22
• 2.2 主要仪器及耗材22-23
• 2.3 主要配方23-25
• 2.4 试验方法25-34
• 2.4.1 病料采集25
• 2.4.2 病理切片25-26
• 2.4.3 病毒分离纯化26
• 2.4.4 电镜观察26
• 2.4.5 病毒生长曲线26-27
• 2.4.6 理化性质27
• 2.4.7 致病性试验27
• 2.4.8 PCR扩增27-28
• 2.4.9 分子流行病学分析28-30
• 2.4.10 gE、gC全基因分析30
• 2.4.11 重组菌构建30-32
• 2.4.13 蛋白表达32-34
• 第三章 结果34-59
• 3.1 临床检验34-35
• 3.2 病毒在组织内分布35-36
• 3.3 病理切片36-37
• 3.4 病毒的分离纯化37-38
• 3.5 电镜观察38
• 3.6 生长曲线38-39
• 3.7 理化特性39
• 3.8 动物试验39-40
• 3.9 分子流行病学分析40-42
• 3.10 gE、gC全基因分析42-50
• 3.11 gC蛋白原核表达载体构建50-54
• 3.12 gC蛋白表达纯化54-57
• 3.13 Western验证57-59
• 第四章 讨论59-63
• 第五章 结论63-64
• 参考文献64-73
• 发表论文和参加科研情况说明73-74
• 致谢74

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