马链球菌诱导RAW264.7细胞和树突状细胞Toll样受体及细胞因子表达的研究

发布时间：2017-07-15 06:47

  本文关键词：马链球菌诱导RAW264.7细胞和树突状细胞Toll样受体及细胞因子表达的研究

  更多相关文章： 马链球菌马亚种 Toll样受体 细胞因子 RAW264.7细胞 树突状细胞

【摘要】：树突状细胞(Dendritic Cells,DCs)和巨噬细胞(Macrophages,MΦs)是马链球菌马亚种(Streptococcus equi subspecies equi,S.equi)感染的主要宿主细胞。当细菌进入机体后会被细胞表面的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)识别,进而通过不同的信号通路途径,启动细胞因子的表达,参与炎症反应。为探究Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)介导的信号通路在S.equi感染宿主细胞中的作用,本研究主要开展了以下两个方面的工作:(1)采用实时荧光定量PCR技术,分析S.equi的感染对RAW264.7细胞TLRs、髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)及细胞因子mRNA表达水平的影响。结果显示,S.equi感染RAW264.7细胞后6 h,TLR1、TLR2、TLR6与MyD88 mRNA表达水平较未感染组变化不明显;感染后12 h,TLR1、TLR2和TLR6 mRNA表达水平未出现变化,而MyD88 mRNA表达水平高于未感染组;感染后24 h,TLR1、TLR2、TLR6、IL-10和IL-12 mRNA表达水平出现明显升高,但是IL-1、IL-6和TNF-αmRNA表达水平均显著下降。结果表明,TLRs介导的信号通路参与S.equi感染RAW264.7细胞的免疫应答反应。(2)利用GM-CSF、IL-4刺激小鼠骨髓细胞使其分化为DCs,S.equi感染DCs后16、20、26 h,采用实时荧光定量PCR技术检测细胞TLRs、MyD88和细胞因子mRNA的表达水平。结果显示,S.equi感染DCs后16、20、26 h,TLR1、TLR2、TLR6、MyD88 mRNA表达水平均高于未感染组。S.equi感染DCs后16、26 h,IL-1 mRNA表达水平较未感染组变化不明显,IL-10和TNF-αmRNA表达水平明显升高。IL-6在S.equi感染DCs后16 h,mRNA表达水平显著上升,但感染后26 h变化不明显。IL-12在S.equi感染DCs后16 h,mRNA表达水平没有变化,但感染后26 h有所升高。通过TLR2阻断型抗体对DCs进行预处理,分别应用流式细胞术和实时荧光定量PCR方法分析TLR2的缺失对DCs成熟标记分子CD80、CD86、MHCII及细胞因子表达的影响。结果显示,TLR2的缺失不能阻断DCs CD80、CD86、MHCII的表达,但是可以显著抑制IL-6、IL-12 mRNA表达水平。结果表明,S.equi具有调节DCs TLRs、MyD88和细胞因子mRNA表达水平的能力,并且S.equi诱导DCs产生IL-6和IL-12可能是依赖TLR2信号通路。综上所述,本研究发现S.equi能够影响RAW264.7细胞和DCs TLRs、MyD88和细胞因子mRNA的表达水平,并且DCs分泌IL-6和IL-12是通过TLR2介导的信号通路实现。这些研究可为明确S.equi与靶细胞之间的相互作用提供试验依据。
【关键词】：马链球菌马亚种 Toll样受体 细胞因子 RAW264.7细胞 树突状细胞
【学位授予单位】：新疆农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 英文缩略表9-10
• 第1章 绪论10-21
• 1.1 马腺疫的研究概况10-13
• 1.1.1 马腺疫对马属动物的危害10
• 1.1.2 马腺疫的致病因素10-12
• 1.1.3 马腺疫的流行情况12-13
• 1.2 Toll样受体信号通路13-17
• 1.2.1 Toll样受体13-15
• 1.2.2 依赖MyD88信号通路/不依赖MyD88信号通路15-16
• 1.2.3 Toll样受体信号通路中细胞因子的分泌16-17
• 1.3 巨噬细胞和树突状细胞在链球菌免疫中的作用17-19
• 1.3.1 巨噬细胞的生物学特性17
• 1.3.2 树突状细胞的生物学特性17-18
• 1.3.3 巨噬细胞和树突状细胞与链球菌之间的相互作用18-19
• 1.4 研究目的及意义19-21
• 第2章 马链球菌感染对RAW264.7 细胞TLR1、TLR2、TLR6、MyD88及细胞因子mRNA表达的影响21-35
• 2.1 材料21-22
• 2.1.1 菌种和细胞株21-22
• 2.1.2 主要试剂22
• 2.1.3 主要仪器22
• 2.2 方法22-28
• 2.2.1 引物设计与合成22-23
• 2.2.2 RAW264.7 细胞的培养23
• 2.2.3 细胞总RNA的提取23-24
• 2.2.4 cDNA的制备24
• 2.2.5 阳性质粒的构建24-27
• 2.2.6 熔解曲线和标准曲线的制备27
• 2.2.7 RAW264.7 细胞的S.equi感染27
• 2.2.8 目的基因mRNA表达水平的检测27-28
• 2.2.9 统计学分析28
• 2.3 结果28-32
• 2.3.1 阳性质粒的鉴定28
• 2.3.2 目的基因的熔解曲线和标准曲线28-31
• 2.3.3 S.equi的感染对RAW264.7 细胞TLR1、TLR2、TLR6和MyD88 mRNA表达的影响31
• 2.3.4 S.equi的感染对RAW264.7 细胞细胞因子mRNA表达的影响31-32
• 2.4 讨论32-35
• 第3章 TLRs介导的信号通路在马链球菌感染小鼠树突状细胞中的作用35-46
• 3.1 材料36-37
• 3.1.1 菌种和细胞株36
• 3.1.2 主要试剂36
• 3.1.3 主要仪器36-37
• 3.2 方法37-39
• 3.2.1 BMDCs的体外诱导培养37
• 3.2.2 BMDCs表型的流式细胞分析37
• 3.2.3 S.equi感染BMDCs37
• 3.2.4 目的基因mRNA表达水平的检测37-38
• 3.2.5 TLR2在S.equi诱导BMDCs表达表面分子中的作用38
• 3.2.6 TLR2在S.equi诱导BMDCs分泌细胞因子中的作用38
• 3.2.7 数据分析38-39
• 3.3 结果39-43
• 3.3.1 BMDCs形态及表型的鉴定39-40
• 3.3.2 S.equi的感染对BMDCs TLR1、TLR2、TLR6和MyD88 mRNA表达的影响40
• 3.3.3 S.equi的感染对BMDCs IL-1、IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α mRNA表达的影响40-41
• 3.3.4 TLR2在S.equi诱导BMDCs表达表面分子中的作用41-42
• 3.3.5 TLR2在S.equi诱导BMDCs分泌细胞因子中的作用42-43
• 3.4 讨论43-46
• 第4章 结论46-47
• 参考文献47-59
• 致谢59-60
• 作者简介60

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本文编号：542714