二甲氧苄啶在猪、鸡和鱼体内的残留消除研究

发布时间：2017-07-16 00:10

  本文关键词：二甲氧苄啶在猪、鸡和鱼体内的残留消除研究

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【摘要】：二甲氧苄啶是一种动物专用的抗菌增效剂,与磺胺药联用能从双重机制阻断敏感菌体内的叶酸合成、抑制细菌的生长繁殖,从而发挥优良的抗菌效应。其用途主要在于预防和治疗鸡的球虫病与动物肠道的感染,自身也可以起到杀灭球虫的效果。但是二甲氧苄啶的毒理学试验证明其具有遗传毒性,所以动物用药后在体内的残留与人类的健康息息相关。药物的残留检测是对可食性动物产品进行安全性评价的重要内容之一,而二甲氧苄啶在畜禽体内残留消除的相关报道比较少。为了完善对二甲氧苄啶的安全评价,确定其在动物体内的残留靶组织、残留标示物、最高残留限量和休药期等,本课题在放射性示踪研究的基础上,开展了二甲氧苄啶与其主要代谢物在猪、鸡和鱼体内的残留消除试验,研究结果将会为二甲氧苄啶的残留检控提供一个科学标准。1二甲氧苄啶主要代谢物对照品的制备以香兰素为原料,氯甲基甲醚为羟基保护试剂,两者的摩尔比为1:1.1,制得浅黄色4-甲氧甲氧基香兰素(产率85%)。以此化合物和丙烯腈为原料,控制摩尔比为1:1.2,在40℃反应4小时,加入硝酸胍,反应得到4-甲氧甲氧基二甲氧苄啶(产率75%)。以此为原料,向溶液中缓慢滴加37%盐酸,反应得到4-脱甲基二甲氧苄啶(DVD1,产率60%)。对其进行各项质量标准研究,结构正确,纯度大于97%,稳定性良好,满足对照品的要求。2二甲氧苄啶及其主要代谢物残留检测方法的建立根据本实验室前期放射性示踪研究的结果,确定二甲氧苄啶的主要代谢物为DVD1(4-脱甲基二甲氧苄啶),DVD2(4-脱甲基二甲氧苄啶葡萄糖醛酸结合物)。本试验建立了DVD及DVD1在猪和鸡的肝脏、肾脏、肌肉、脂肪(皮脂)、心、肺、胃、ii大肠和小肠9种组织;鱼的肝脏、肾脏、肌肉、皮肤及胃肠道5种组织中的高效液相色谱检测方法。样品经乙酸乙酯提取,MCX小柱净化,0.01%氨水和甲醇(71:29,V/V)混合试剂复溶,通过HPLC进行检测。样品若需水解,则先加入3 m L 0.2 mol/L的醋酸铵缓冲液,40μL的β-葡萄糖醛酸酶37℃孵育12 h,冷却到室温后再进行提取。具体的液相条件如下,色谱柱:ZORBAX Extend C18(4.6×250 mm,5μm);流动相:A:0.01%氨水,B:甲醇(71:29,V/V);紫外检测波长:276 nm;进样量:30μL;柱温:30℃。该方法下DVD和DVD1在猪、鸡和鲤各组织的LOQ为40μg/kg。动物各商品及非商品组织中添加3个不同定量限水平的药物,回收率均在70%以上,且日间相对标准偏差在14%以下。本课题建立的残留检测方法可以满足定量分析要求,能用于二甲氧苄啶及其代谢产物的残留检测分析。3二甲氧苄啶在猪、鸡和鱼体内的残留消除研究按照兽药典推荐剂量和方法口服二甲氧苄啶,研究二甲氧苄啶及其代谢物在3种食品动物体内的动态变化规律,进一步确证二甲氧苄啶在猪、鸡和鲤体内的残留标识物与靶组织。24头健康的三元杂交猪,36羽20日龄科宝肉鸡和30尾健康鲤鱼,按照二甲氧苄啶10 mg/kg b.w.连续灌胃7 d。停药后在不同的时间点宰杀动物,取猪和鸡的9种组织,鱼的5种组织。按照上述方法测定二甲氧苄啶及其主要代谢物的残留量,结果如下:猪:停药6 h,各组织均检测到DVD1和DVD,药物浓度范围分别为63.2-519.9μg/kg,357.5-2297.0μg/kg,肾脏浓度最高。1 d后肌肉、心脏、肺脏和小肠中已检测不到DVD1,DVD浓度也大幅降低。停药3 d,大部分组织中DVD1浓度低于LOQ,仅肝脏、肾脏、脂肪中能检测出DVD1,浓度分别为77.6μg/kg,190.1μg/kg,51.9μg/kg;停药5 d,所有组织中DVD1的浓度均降至定量限以下,在脂肪、心脏、胃、大肠、小肠中DVD浓度也消除至定量限附近。停药7 d,肝脏和肾脏DVD的浓度分别是96.5μg/kg和115.1μg/kg,其余各组织中的药物含量均低于定量限。14 d,所有组织均已检测不到药物存在。用葡萄糖醛酸酶处理猪的各组织后,发现6 h和1 d在猪的肝脏和肾脏中DVD1的浓度有所增加,6 h的浓度分别为319.4μg/kg和942.8μg/kg,肾脏中DVD1的含量变化较大,说明6 h肾脏中DVD2的浓度比较高;1 d时肝脏、肾脏中DVD1的浓度为199.3μg/kg和680.5μg/kg;3 d后DVD1的浓度已无明显变化,可见其消除速度较快。结果表明,二甲氧苄啶在猪体内的残留量低,残留物消除迅速,DVD原形为残留标示物,肾脏为残留靶组织。鸡:停药6 h,除心脏和小肠外所有组织中均能检测到DVD1和DVD,浓度范围分别是53.6-738.5μg/kg、3356.4μg/kg-8541.4μg/kg;停药1 d,仅肾脏中能检测到DVD1,浓度为45.8μg/kg,DVD消除也比较快,各组织中浓度下降至327.5-1764.6μg/kg;停药3 d,DVD1在所有组织中消除至LOQ之下;停药7 d,DVD在肝脏中的浓度是107.4μg/kg,在肾脏中的浓度是118.7μg/kg,其他组织中DVD的浓度均在100.0μg/kg以内;停药9 d,肝脏中DVD的浓度为68.1μg/kg,肾脏中浓度为77.8μg/kg,其他组织已检测不到任何药物。用葡萄糖醛酸酶处理各组织后只在6 h的肝脏和肾脏检测到DVD1的含量有所增加,分别是987.2μg/kg和612.3μg/kg,1d后DVD1的含量已无明显变化,表明DVD2消除速度非常快,残留时间很短。综上发现DVD1、DVD2在鸡各组织中消除迅速,残留时间最长的化合物为DVD。结果证明,二甲氧苄啶在鸡的残留靶组织是肾脏,残留标示物是原型。鱼:停药6 h,肝脏、肾脏、肌肉、皮肤和胃肠道仅能检测到原型DVD,酶解后也未检测到DVD1,说明鱼组织中没有DVD1和DVD2的残留或残留量低于检测限。但是各组织中DVD的浓度都比较高,浓度范围在6632.9-8671.0μg/kg,肾脏最高;停药1d后,各组织中DVD浓度在2539.6-5265.6μg/kg;停药7 d,各组织中的DVD浓度消除至401.6μg/kg之下;停药14 d,肝脏中DVD浓度为77.6μg/kg,肾脏中为99.7μg/kg,其余组织中DVD浓度已消除至LOQ以下。可见二甲氧苄啶在鱼各组织中浓度较高,但消除迅速,残留标示物为DVD,残留靶组织为肾脏。4猪和鸡可食性组织中二甲氧苄啶最高残留限量和休药期的制订本研究,按照美国FDA和欧盟EMEA兽药食品安全性评价的原则和方法,制定二甲氧苄啶的MRLs和WDT。按照FDA的原则,二甲氧苄啶在猪和鸡体内的休药期均为1 d。在猪肝、肾、肌肉和脂肪中的MRL分别为791、1067、334和1938μg/kg;在鸡肝、肾、肌肉和脂肪中的MRL分别为972、1951、367和2138μg/kg;按照EMEA的原则,二甲氧苄啶在猪和鸡体内的休药期分别为10和12 d,在猪和鸡的肝、肾、肌肉和脂肪(皮脂)的MRL均为100μg/kg。综合分析两个程序评价结果,建议采用相对保守的EMEA的评价程序所制定的休药期和残留限量标准。综上所述,本课题首次制备出1种二甲氧苄啶主要代谢物的对照品,并建立二甲氧苄啶及其主要代谢产物在猪、鸡和鲤商品和非商品组织中的残留检测方法,同时对二甲氧苄啶在猪、鸡和鲤鱼体内的残留消除规律进行了系统的研究,对残留标示物和残留靶组织进行了进一步的确证,制定出了在猪和鸡体内的最高残留限量和休药期,其研究结果为临床合理用药、药物安全性评价等提供了科学依据。
【关键词】：二甲氧苄啶 主要代谢物 残留消除 高效液相色谱 最高残留限量 休药期
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S859.84;S948
【目录】：

• 摘要8-12
• Abstract12-16
• 缩略语表16-19
• 1 前言19-26
• 1.1 立题依据19-22
• 1.2 二甲氧苄啶的研究进展22-26
• 1.2.1 二甲氧苄啶的代谢研究22-24
• 1.2.2 二甲氧苄啶的残留消除研究24-26
• 1.3 研究内容与目标26
• 2 材料与方法26-34
• 2.1 药品和试剂26-27
• 2.2 主要仪器和设备27-29
• 2.3 二甲氧苄啶主要代谢物对照品的制备29-30
• 2.3.1 DVD1的合成方法29
• 2.3.2 DVD1的结构表征鉴定、纯度及理化性质研究29-30
• 2.4 二甲氧苄啶及其主要谢物在动物可食性组织中残留检测方法的建立30-33
• 2.4.1 溶液的配制30-31
• 2.4.2 HPLC色谱条件31
• 2.4.3 样品处理方法31-32
• 2.4.4 特异性32
• 2.4.5 最低检测限与最低定量限32
• 2.4.6 标准曲线32
• 2.4.7 准确度与精密度32-33
• 2.4.8 稳定性考核33
• 2.5 二甲氧苄啶在猪、鸡和鱼体内的残留消除研究33-34
• 2.5.1 实验动物33
• 2.5.2 给药与样品采集33-34
• 2.5.3 样品定量及数据处理34
• 3 结果与分析34-70
• 3.1 二甲氧苄啶主要代谢物对照品制备的结果34-38
• 3.1.1 DVD1的结构鉴定34-37
• 3.1.2 DVD1的纯度、熔点、吸光系数和稳定性结果37-38
• 3.2 二甲氧苄啶及其主要代谢物在动物可食性组织中的定量方法学结果38-48
• 3.2.1 特异性38
• 3.2.2 最低检测限与最低定量限38
• 3.2.3 标准曲线的建立38-39
• 3.2.4 回收率与相对标准偏差39-48
• 3.2.5 稳定性结果48
• 3.3 二甲氧苄啶及其主要代谢物在3种动物组织中的残留消除规律48-70
• 3.3.1 二甲氧苄啶及其主要代谢物在猪组织中的残留消除规律48-56
• 3.3.2 二甲氧苄啶及其主要代谢物在鸡组织中的残留消除规律56-64
• 3.3.3 二甲氧苄啶及其主要代谢物在鱼组织中的残留消除规律64-70
• 4 二甲氧苄啶在食品动物的安全性评价70-77
• 4.1 FDA71-73
• 4.1.1 每日允许摄入量(ADI)71
• 4.1.2 安全浓度（Safety Concentration, SC）71-72
• 4.1.3 残留靶组织与残留标示物72
• 4.1.4 最高残留限量（MRLs）72-73
• 4.1.5 休药期73
• 4.2 EMEA73-77
• 4.2.1 每日允许摄入量(ADI)73
• 4.2.2 安全浓度（Safety Concentration, SC）73-74
• 4.2.3 残留靶组织与残留标示物74
• 4.2.4 最高残留限量(MRLs)74
• 4.2.5 计算TMDI74-75
• 4.2.6 休药期75-77
• 5 讨论77-82
• 5.1 二甲氧苄啶主要代谢物对照品的制备77
• 5.2 二甲氧苄啶及其主要代谢物的定量方法学讨论77-79
• 5.3 二甲氧苄啶在食品动物体内的残留消除规律79-82
• 6 全文总结82-83
• 7 文献综述83-98
• 7.1 作用机制83-84
• 7.2 应用于临床的抗菌增效剂84-97
• 7.2.1 甲氧苄啶84-87
• 7.2.2 二甲氧苄啶87-92
• 7.2.3 巴喹普林92-95
• 7.2.4 溴莫普林95-97
• 7.3 存在的问题及其原因、解决办法和可行性分析97-98
• 参考文献98-105
• 致谢105-106
• 附录Ⅰ---作者简介106-107
• 附录Ⅱ---定量方法学原始数据107-119
• 附录Ⅲ---3种动物各个体的药物浓度119-126
• 对各答辩委员的答复书126-127

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本文编号：546334