2014～2016年东营及盐城地区野鸟与家禽中AIV监测及其遗传进化研究

发布时间：2017-07-18 01:23

  本文关键词：2014～2016年东营及盐城地区野鸟与家禽中AIV监测及其遗传进化研究

  更多相关文章： H9N2亚型AIV H5N1亚型AIV 候鸟 家禽 遗传多样性

【摘要】：禽流感,全名鸟禽类流行性感冒。禽流感病毒(Avain Influenza Virus,AIV)属于正粘病毒科流感病毒属。AIV全基因组由8个负链的单链RAN组成,分别为PB2,PB1,PA,HA,NP,NA,M,和NS基因。目前已发现16种HA和9种NA,其互相组合形成了多种AIV亚型,如H9N2亚型、H5N1亚型。野鸟被认为是AIV的天然宿主,但野鸟携带的禽流感病毒一般不直接感染人。近期我国爆发的新型H7N9和H10N8禽流感疫情严重威胁公共健康,并给我国的家禽养殖业造成了巨大的经济损失(Chen et al.,2014)。研究表明,两者均为低致病性AIV,其HA和NA的来源均与东亚-澳大利亚迁徙路线上的野鸟有关,而内部基因来自家禽中流行的H9N2亚型AIV。因此,对我国迁徙候鸟及其栖息地区家禽中AIV的监测、对野鸟和家禽携带的AIV的遗传多样性、对不同栖息地间AIV传播的时空特征的研究工作具有重要的意义。本研究以入选国际重要湿地名录的黄河三角洲(山东东营)和江苏盐城湿地作为东亚-澳大利亚迁徙路径上的北、南两个研究基地,自2014年11月至2016年2月从两研究基地共进行了6次采样,其中东营和盐城各采样3次。共采集粪便、拭子等样本6570份,其中家禽样本3093份,野鸟样本3477份。利用AIV通用型引物,Taq Man探针荧光定量PCR(Real-time PCR)方法检测样本中AIV阳性率。活禽市场家禽样本中AIV阳性率为8.8%~35.0%(22/250~210/600),野鸟中AIV阳性率为0.3%~9.4%(2/688~78/826)。利用普通PCR方法对Real-time PCR测得Ct值30的样本进行H5亚型鉴定。将非H5亚型的样本接种9~11日龄SPF鸡胚进行病毒分离。H5亚型样本送往国家疾控中心微生物所进行病毒分离。共分离到29株H9N2、13株H5N1、2株H3N2、2株H5N2和2株H5N1+H3N2的混合感染毒株。其中除3株H9N2分离自盐城外,其他毒株均来自东营。除3株H9N2分离自东营地区野鸟外,其他均分离自家禽。并利用二代测序测得所有毒株的50个全基因组序列。自东营的前两次采样中获得25株AIV毒株。其中H9N2亚型占88%(22/25),H5N1亚型占4%(1/25)。而自东营的第三次采样中获得的22个AIV毒株中H9N2亚型占18.2%(4/22),H5N1亚型毒株占63.6%(14/22)。这一数据说明东营地区的主要流行亚型可能由H9N2转变为H5N1亚型。选取上述分离自东营的2株野鸟源、20株鸡源和盐城的3株鸡源株(共25株)H9N2亚型AIV全基因组,进行了分子特征、系统发育及溯源分析。自NCBI数据库下载每个毒株对应的100条与其亲缘关系最近的序列,用Muscle软件将参考序列与本研究选取的序列对齐后,利用RAx ML软件构建基因进化树。根据树形与Bootstrap值对8个基因片段的进化树进行了组别划分,并根据这一划分,最终将所述的25个AIV分为九个新的基因型。22个分离自东营的毒株在这九个基因型中均有分布,这表明东营地区的H9N2具有高度的遗传多样性,说明它们可能经历了频繁的基因重配。此外,基因型6中的毒株内部基因除一个毒株的PB2基因外其他均与基因型1(由分离自东营的两野鸟株组成)中的相同。这一证据可能暗示了病毒在野鸟与家禽之间的传播。选取自东营某养鸭场分离到一株鸭源H5N1亚型AIV,将该毒株命名为A/Duck/Shandong/1-14/2014(H5N1),用以研究我国流行的H5N1高致病性AIV的进化与传播。对病毒HA基因进行系统发育分析表明其属于2.3.2.1c家系。根据其他基因的系统发育进化树发现,除了PB2基因来自于H9N2亚型外,其余7个基因均来自于H5N1。该毒株与北美首例人感染H5N1和造成2015年1月河南三门峡野鸟疫情的毒株属于同一个基因型,为2.3.2.1c中一个新近报道的基因型。并且该基因型病毒于不同时间点在我国的北京、山东和河南等地的家禽和野鸟中出现,表明其已具备了一定的适应性并在持续传播。尚未发现该基因型的毒株在关键氨基酸位点发生变异。本研究为2014年11月至2016年2月在我国东部地区迁徙候鸟和当地家禽中AIV流行情况提供了重要的监测数据,证明了沿东亚-澳大利亚迁徙路线AIV的高遗传多样性。将预防人感染低致病性禽流感提前到野鸟-家禽窗口,对潜在的感染人的AIV进行提前预警。
【关键词】：H9N2亚型AIV H5N1亚型AIV 候鸟 家禽 遗传多样性
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S855.3
【目录】：

• 符号说明5-9
• 中文摘要9-11
• ABSTRACT11-14
• 1 前言14-24
• 1.1 流感概述14-16
• 1.1.1 禽流感病毒基因组成14-15
• 1.1.2 禽流感病毒株命名原则15
• 1.1.3 禽流感病毒危害15-16
• 1.2 候鸟迁徙16-18
• 1.3 候鸟与家禽携带的禽流感病毒18-19
• 1.4 近期我国感染人的禽流感病毒的溯源19
• 1.5 H9N2亚型禽流感19-22
• 1.5.1 H9N2亚型禽流感的流行现状20
• 1.5.2 野鸟中H9N2亚型禽流感病毒20
• 1.5.3 家禽中H9N2亚型禽流感病毒20-21
• 1.5.4 H9N2亚型禽流感病毒基因的进化21-22
• 1.6 H5N1亚型禽流感22-23
• 1.6.1 H5N1亚型AIV的流行现状22
• 1.6.2 H5N1亚型AIV的基因进化22-23
• 1.7 本研究的意义23-24
• 2 材料方法24-35
• 2.1 试验材料24-26
• 2.1.1 实验试剂24
• 2.1.2 个人防护装备24
• 2.1.3 实验耗材24-25
• 2.1.4 实验仪器25-26
• 2.2 试验方法26-35
• 2.2.1 采样物品准备26
• 2.2.2 样本采集26-27
• 2.2.3 样本处理27-28
• 2.2.4 样本中RNA的提取28-29
• 2.2.5 CDNA合成29
• 2.2.6 荧光定量PCR检测29-31
• 2.2.7 病毒亚型测定31-32
• 2.2.8 病毒分离32-33
• 2.2.9 增殖后病毒载量测定33-34
• 2.2.10 病毒全基因组测定34
• 2.2.11 系统发生分析34-35
• 2.2.12 分子特征分析35
• 3 实验结果35-54
• 3.1 2014 年~2016 年东营与盐城两地野鸟与家禽AIV流行病学调查与研究35-43
• 3.1.1 样本采集背景与数量35-36
• 3.1.2 野鸟与活禽市场家禽中甲型流感阳性率检测36-38
• 3.1.3 东营与盐城AIV阳性样本分离到毒株分析38-43
• 3.2 2014.11-2015.3 东营与盐城两地野鸟与家禽中分离的H9N2禽流感毒株系统发生分析43-50
• 3.2.1 基因进化树分析43-50
• 3.3 2014 年自东营某养鸭场获得的一株H5N1亚型禽流感毒株分子特征与系统发育分析50-54
• 3.3.1 荧光定量PCR鉴定及PCR分型50
• 3.3.2 系统发育分析50-51
• 3.3.3 分子特征分析51-54
• 4 讨论54-56
• 4.1 2014 年~2016 年东营与盐城两地野鸟与家禽AIV流行病学调查与研究54-55
• 4.2 2014.11-2015.3 东营与盐城两地野鸟与家禽中分离的H9N2禽流感毒株系统发生分析55
• 4.3 2014 年自东营某养鸭场获得的一株H5N1亚型禽流感毒株分子特征与系统发育分析55-56
• 5 结论56-58
• 5.1 2014 年~2016 年东营与盐城两地野鸟与家禽AIV流行病学调查与研究56-57
• 5.2 2014.11-2015.3 东营与盐城两地野鸟与家禽中分离的H9N2禽流感毒株系统发生分析57
• 5.3 2014 年自东营某养鸭场获得的一株H5N1亚型禽流感毒株分子特征与系统发育分析57-58
• 参考文献58-65
• 致谢65-66
• 攻读学位期间发表论文情况66

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本文编号：555439