原代奶牛乳腺上皮细胞的分离、培养和传代的技术研究

发布时间：2017-07-18 07:04

  本文关键词：原代奶牛乳腺上皮细胞的分离、培养和传代的技术研究

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【摘要】：利用动物乳腺来生产药用蛋白是生物高新技术中重要的内容,对乳腺上皮细胞的探索从未停止。自小鼠转基因起,动物细胞技术平台已经渐渐地建立起来。乳腺上皮细胞具有分泌性,是一种功能细胞,乳腺正是依靠该细胞来进行泌乳。作为乳腺泌乳的基础,乳腺上皮细胞对于探究泌乳的启动、功能维持和退化等生理过程来说,是一种必需的材料,没有这种材料,无法研究基因表达和信号传导等问题。目前,体外培养奶牛乳腺上皮细胞存在一些问题,复杂的过程和有限的传代次数导致成功率不是很高。通常情况下,即使培养成功,乳腺上皮细胞也会失去一些生物学功能,这就使得这些细胞一般仅能用于科学研究,利用其进行工业生产等实际应用,难度较大。就国内而言,成功培养奶牛乳腺上皮细胞的示例不多。即使在成功的实例中,对于如何分离、培养和传代乳腺上皮细胞,也没有一个比较明确的结论。由上述背景可以看出,当前亟待解决的问题一个是创立新的方法或者改善现有方法来有效地分离培养和传代奶牛乳腺上皮细胞,另一个就是建立什么技术指标来检测纯化的乳腺上皮细胞。所以,研究奶牛乳腺上皮细胞体外分离、培养、传代技术是很有意义的。本文研究选取的实验材料来自于健康的荷斯坦奶牛乳腺组织,使用组织块接种法体外培养并得到了奶牛乳腺上皮细胞。并且在成功获得奶牛乳腺上皮细胞后,使用了细胞角蛋白的免疫荧光(IF)染色和蛋白质免疫印记(WB)对乳腺上皮细胞进行了鉴定。通过对细胞在分离、培养、传代中光学显微镜下的观察和对细胞冻存和复苏方法的研究,建立了清楚的原代奶牛乳腺上皮细胞培养方法。与此同时,对用不同方法冻存的奶牛乳腺上皮细胞进行复苏,而后测定了细胞的贴壁率。除此之外,还检测了奶牛乳腺上皮细胞中的甘油三酯、乳糖和酪蛋白这些营养物质以及细胞的增殖规律。这些检测结果,从各个方面体现出了处于不同代数的奶牛乳腺上皮细胞泌乳的差异,进而为奶牛乳腺上皮细胞后面的实验提供了基础和参考。本实验结果表明,通过组织块贴壁培养法分别分离得到乳腺上皮细胞和成纤维细胞的原代培养物。对经过角蛋白的免疫荧光(IF)染色和蛋白质免疫印记(WB)鉴定的乳腺上皮细胞进行传代培养。用不同方法冻存的奶牛乳腺上皮细胞进行复苏,B组方法(将冻存管放置自制泡沫盒中)冻存后复苏效果最好,贴壁率为91.2%。建议使用此方法冻存细胞。通过对不同代数的乳腺上皮细胞的乳糖、乳脂、乳蛋白和细胞增殖进行检测,结果表明前十代乳腺上皮细胞其分泌的乳糖、乳脂、乳蛋白变化不明显,其中乳糖、乳脂、乳蛋白在第十五代时分泌减少的很明显,细胞增殖在第十二代时增殖缓慢。确定1-10代奶牛乳腺上皮细胞可用于体外研究。
【关键词】：奶牛 乳腺上皮细胞 原代培养 传代培养
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
【目录】：

• 摘要8-9
• 英文摘要9-11
• 1 前言11-19
• 1.1 动物细胞培养的研究11-14
• 1.1.1 动物细胞培养研究的历史11
• 1.1.2 动物细胞培养技术的应用11-12
• 1.1.3 动物细胞系的建立12-13
• 1.1.4 动物细胞系的生长特点与应用13
• 1.1.5 动物细胞的低温保存13-14
• 1.2 乳腺上皮细胞培养的研究进展14-16
• 1.2.1 乳腺上皮细胞培养的方法14-15
• 1.2.2 乳腺上皮细胞的应用15
• 1.2.3 影响乳腺上皮细胞发育的因素15-16
• 1.2.4 乳腺上皮细胞的研究进展16
• 1.3 乳腺上皮细胞泌乳和增殖16-18
• 1.3.1 乳蛋白16-17
• 1.3.2 乳脂17
• 1.3.3 乳糖17
• 1.3.4 乳腺上皮细胞的增殖17-18
• 1.4 实验目的与意义18-19
• 2 材料和方法19-26
• 2.1 实验主要材料19-20
• 2.1.1 实验试剂19
• 2.1.2 主要实验仪器和设备19-20
• 2.1.3 实验动物和细胞20
• 2.2 实验方法20-25
• 2.2.1 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养20
• 2.2.2 奶牛乳腺上皮细胞的传代培养和纯化20
• 2.2.3 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定20-21
• 2.2.4 奶牛乳腺上皮细胞形态的观察21
• 2.2.5 奶牛乳腺上皮细胞的冻存和复苏21-22
• 2.2.6 奶牛乳腺上皮细胞泌乳和增殖22-25
• 2.3 数据分析25-26
• 3 结果与分析26-43
• 3.1 奶牛乳腺上皮细胞原代培养26-28
• 3.2 奶牛乳腺上皮细胞的纯化28-31
• 3.3 奶牛乳腺上皮细胞光学显微镜观察31-32
• 3.4 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的鉴定32-33
• 3.5 奶牛乳腺上皮细胞传代培养33-36
• 3.6 奶牛乳腺上皮细胞的冻存和复苏36-37
• 3.7 奶牛乳腺上皮细胞的增殖37-40
• 3.8 奶牛乳腺上皮细胞乳糖含量测定40-41
• 3.9 奶牛乳腺上皮细胞甘油三酯含量测定41-42
• 3.10 奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白含量测定42-43
• 4 讨论43-45
• 4.1 原代奶牛乳腺上皮细胞的分离、纯化和传代43
• 4.2 奶牛乳腺上皮细胞的泌乳和增殖43-44
• 4.3 奶牛乳腺上皮细胞的冻存与复苏44-45
• 5 结论45-46
• 致谢46-47
• 参考文献47-52
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文52

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本文编号：556486